1.研究背景和意义肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,超过一半的肝癌患者来自于中国。肝癌的转移和复发是导致肝癌患者预后较差的主要原因。研究肝癌转移的分子机制对于肝癌的治疗有重要的意义。目前,医学模式已经向生物-心理-社会医学模式转变,社会心理因素对恶性肿瘤的影响引起了越来越多的关注。研究表明恶性肿瘤患者长期处于应激状态,慢性应激被证实通过调控肿瘤细胞,肿瘤微环境和机体免疫系统等影响肿瘤的进展。慢性应激能够促进交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)活化释放儿茶酚胺类应激激素,交感神经系统对肿瘤发生发展具有调控作用,去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)被证实能够促进肿瘤细胞侵袭和迁移。但慢性应激是否通过激活SNS调控肝癌的转移还未见报道,因此,研究肝癌患者慢性应激状态对肿瘤进展的影响将从心理-神经-内分泌的全新角度阐释肝癌转移的分子机制,揭示慢性应激促肝癌转移的新理论。肿瘤细胞的侵袭和迁移能力的改变是一个复杂的过程,肿瘤细胞骨架重塑,细胞粘附力改变以及上皮-间质样转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生是肿瘤细胞转移的重要因素。交感神经末梢分布于多种肿瘤组织,研究表明应激激素NE能够通过激动卵巢癌细胞表面肾上腺素受体(Adrenergic receptors,ARs)介导人端粒酶逆转录酶的表达,调控卵巢癌细胞发生EMT;还能够通过激活β-AR/HIF-1α信号通路促进肿瘤细胞发生EMT,进而调控胃癌和结肠癌细胞的侵袭和转移。肝癌患者长期的慢性应激状态是否通过激活SNS释放应激激素直接激动肝癌细胞表面ARs,介导肝癌细胞发生EMT仍不清楚。本研究的目的是:1.研究肝癌患者慢性应激状态对肝癌转移及预后的影响;2.探讨慢性应激激活交感神经系统调控肝癌细胞关键ARs及下游信号通路活化促肝癌细胞EMT发生的分子机制。阐明慢性应激促肝癌转移的分子机制将为寻找防治肝癌转移的新策略提供理论基础和实验依据。2.主要研究方法(1)通过心率变异分析仪检测肝癌患者应激指数和心率变异性(Heart rate variability,HRV)指标变化情况,利用ELISA检测肝癌患者血中NE和肾上腺素(Epinephrine,EPI)的浓度;建立肝癌患者慢性应激评价体系,并分析肝癌患者慢性应激状态与肝癌患者临床病理特征,术后复发、转移及生存时间的相关性。(2)构建稳定表达荧光素酶基因的肝癌细胞株(SMMC-7721-Luc-cherry),并以此细胞建立裸鼠慢性应激-肝癌原位移植瘤模型,利用小动物成像系统观察慢性应激状态对肝癌原位移植瘤转移的影响,研究慢性应激对荷瘤裸鼠生存时间的影响。(3)基于裸鼠慢性应激-肝癌原位移植瘤模型,利用小动物活体成像系统观察6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)化学性去除交感神经末梢后慢性应激刺激对移植瘤模型中肝癌转移的影响,阐明慢性应激通过激活交感神经系统促进肝癌转移。(4)RT-PCR和免疫荧光检测肝癌细胞表达ARs情况,利用交感神经递质(去甲肾上腺素等)和多种肾上腺素受体阻滞剂(普萘洛尔等)作用于肝癌细胞,通过Transwell侵袭和迁移实验,划痕实验,Western blot等离体研究交感神经递质对肝癌细胞侵袭和迁移的影响,筛选出介导肝癌细胞侵袭和转移能力改变的重要肾上腺素能受体亚类。(5)利用慢病毒质粒干扰与调控肝癌细胞侵袭和转移有关的肾上腺素受体亚型,基于慢性应激-裸鼠肝癌原位移植瘤模型研究明确在慢性应激调控肝癌转移的进程中,发挥关键作用的肾上腺素能受体亚型。(6)通过慢病毒质粒干扰或特异性阻滞剂阻断关键肾上腺素受体,利用Transwell侵袭和迁移实验,Western blot实验等,研究激动关键肾上腺素受体介导肝癌细胞侵袭转移相关因子表达促进肝癌细胞侵袭和转移的分子机制,明确肝癌细胞EMT重要基因的调控作用。(7)利用原子力显微镜,免疫荧光等技术研究激动肝癌细胞关键肾上腺素受体促其转移进程中,细胞形态,细胞骨架和细胞硬度等生物力学特征的变化,证实肝癌细胞在这一进程中发生了EMT。(8)通过PCR芯片检测与调控肝癌进展相关的84种基因,找到激动肝癌细胞关键肾上腺素能受体参与调控EMT进程的重要信号分子,探讨激动关键肾上腺素受体对该信号分子的调控作用。(9)利用双荧光素酶报告基因检测系统和染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP)实验等,研究关键AR及其下游信号转导通路在介导EMT调控转录因子活化中的作用,阐明激动关键AR介导下游信号通路活化促肝癌细胞EMT的分子机制。(10)通过免疫组化实验等研究临床肝癌标本中关键信号分子的表达情况及其与肝癌患者应激指数,应激激素和患者临床病理特征以及预后的相关性。3.结果(1)心率变异分析和血液NE和EPI浓度检测结果显示:肝癌患者应激指数,HRV水平分别与应激激素具有明显的相关性,利用三者联合可以较好的评估肝癌患者慢性应激状态。进一步分析发现应激指数高低与肿瘤大小,血管癌栓,肝内转移,TNM分期,术后复发情况明显相关,还与肝癌患者的无疾病生存期和总生存期呈负相关关系;HRV时间域指标窦性心搏RR间期标准差(Standard deviation of the NN intervals,SDNN;相邻RR间期差值的均方根(Square root of the mean squared differences of successive NN intervals,RMSSD)和频率域指标低频率(Low frequency,LF),高频率(High frequency,HF),总功率(Total power,TP)的高低与肝癌患者的无疾病生存期,总生存期呈正相关。患者血中应激激素NE浓度与血管癌栓,TNM分期,术后复发具有明显相关性;EPI浓度与肿瘤大小,血管癌栓,分化程度,TNM分期和术后复发有关;且NE和EPI浓度均与肝癌患者无疾病生存期和总生存期呈负相关。(2)小动物活体成像结果提示:慢性应激能够促进肝癌原位移植瘤模型中肝癌的肝内和远处转移;ELISA检测结果发现慢性应激能够促进裸鼠肝组织内NE和EPI浓度上升,高浓度的NE和EPI可能与模型中肝癌的转移有关;生存分析提示慢性应激能够明显缩短荷瘤裸鼠的总生存期。(3)6-OHDA去除交感神经纤维后,明显降低了慢性应激刺激对移植瘤模型中肝癌转移的促进作用;肝组织内的NE和EPI浓度也明显降低;去除交感神经末梢后能够延长慢性应激状态下荷瘤裸鼠的总生存期。(4)免疫荧光和Western blot检测发现多种肝癌细胞表达肾上腺素能受体。Transwell,划痕实验结果显示:去甲肾上腺素能够促进肝癌细胞的侵袭和迁移,利用阻滞剂阻断β-ARs能够抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,而α-ARs阻滞剂抑制肝癌细胞侵袭和迁移的作用不明显。RT-PCR和Western blot检测与侵袭转移相关的蛋白发现:激动肝癌细胞β-ARs上皮样标记E-cadherin下调,间质样标记N-cadherin和Vimentin上调,阻断β-ARs后这种调控作用受到抑制;而阻断β-ARs对基质金属蛋白酶2和9(matrix metalloproteinase 2,MMP2;matrix metalloproteinase 9,MMP9)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等的抑制作用不明显。(5)利用慢病毒干扰质粒分别干扰β1-,β2-,β3-AR,小动物活体成像结果提示:干扰β2-AR能够抑制慢性应激促移植瘤模型中肝癌的肝内和远处转移的作用,而干扰β1,β3-AR对肝癌转移的影响不大;生存分析还发现干扰β2-AR能够延长慢性应激状态下荷瘤裸鼠的总生存期。(6)Transwell侵袭和迁移实验发现,激动β2-AR能够促进肝癌细胞侵袭和迁移,干扰或阻滞β2-AR能够抑制肝癌细胞侵袭和迁移;Western blot结果证实异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)激动β2-AR能够抑制肝癌细胞E-cadherin的表达,促进N-cadherin和Vimentin的表达,干扰或特异性阻断β2-AR能够抑制ISO对这三个蛋白的调控作用。RT-PCR和Western blot实验结果发现激动β2-AR能够促进EMT调控转录因子Vimentin的表达,干扰或阻滞后能够抑制其表达。(7)原子力显微镜观察扫描后发现:激动β2-AR能够促进肝癌细胞形态发生变化,细胞间紧密连接减弱,伸出伪足,细胞表面颗粒增多,粗燥程度变大,特异性阻断β2-AR后,能够抑制细胞形态的改变。免疫荧光检测骨架蛋白Vimentin和F-肌动蛋白(F-actin)后发现激动β2-AR促进Vimentin表达上调和F-actin累积,且F-actin出现异常排列和形态,阻滞β2-AR后Vimentin表达和F-actin累积减少,细胞骨架重塑受到抑制。原子力显微镜检测肝癌细胞硬度后发现,ISO能够降低肝癌细胞硬度(硬度越小说明细胞的形变能力越大),阻滞了β2-AR后肝癌细胞的硬度升高。(8)PCR芯片结果提示:与对照组相比,ISO激动肝癌细胞β2-AR能够调控基因表达差异大于5倍以上的,且与肝癌进展相关的基因有8个:ANGPT2,CCL5,EGF,LEF1,MTDH,STAT3,PIN1;其中CDH1(E-cadherin)为明显下调的基因。进一步分析发现,与激动剂组相比,ISO+ICI118551(β2-AR特异性阻滞剂)组表达下调超过5倍的基因有4个:Myc,CCND1,LEF1;而CDH1(E-cadherin)明显上调。其中LEF1和CDH1(E-cadherin)基因的在两组中表达差异有明显此消彼长的现象,说明激动β2-AR对上述两个基因具有明显的调控作用。利用RT-PCR和Western blot验证LEF1(CDH1(E-cadherin)在之前的研究中已经证实了β2-AR对其表达的调控作用)在SMMC-7721和Hep G2肝癌细胞的表达发现,激动β2-AR能促进LEF1蛋白和转录水平的表达,而阻滞β2-AR能够抑制其表达。(9)根据PCR芯片结果,激动或阻滞β2-AR后参与侵袭转移调控的基因LEF1和Myc,CCND1,MTDH等的表达发生变化,而LEF1等这些基因均与β-catenin信号通路的活化相关。进一步分析芯片结果发现β-catenin在激动或阻滞肝癌细胞β2-AR后没有明显表达变化,Western blot检测也发现蛋白水平的β-catenin在两组间没有表达差异。文献检索发现β-catenin信号通路的激活多与其核内表达上调有关,进一步通过免疫荧光和Western blot检测发现:激动肝癌细胞β2-AR能够促进β-catenin细胞核内表达,特异性阻断β2-AR抑制了β-catenin的入核。Western blot检测还发现激动β2-AR后,随着β-catenin核内表达增多,LEF1,Vimentin和N-cadherin上调,而E-cadherin表达降低。干扰β-catenin后能够抑制β2-AR激动剂促肝癌细胞侵袭和迁移的作用。生物信息学分析提示β-catenin能够入核与LEF1等转录因子形成复合物调控Vimentin转录,Ch IP实验证实β-catenin能够与Vimentin启动子结合;双荧光素酶报告基因检测Vimentin启动子活性,发现干扰β-catenin能够抑制Vimentin的启动子活性,证实β-catenin能够调控Vimentin的转录介导肝癌细胞骨架重塑和EMT发生。(10)免疫组化检测肝癌临床标本中β-catenin的表达分布情况发现:临床肝癌标本中β-catenin的核表达与肝癌患者应激指数,应激激素NE和EPI浓度呈正相关;进一步研究发现细胞核有β-catenin表达的患者总生存时间较短,证实慢性应激激活β2-AR促进β-catenin入核调控下游EMT基因表达是慢性应激促进肝癌转移中的关键调控机制。4.结论(1)慢性应激通过激活交感神经系统促进肝癌转移导致肝癌患者预后较差,评估肝癌患者慢性应激状态有助于预测患者预后。(2)慢性应激通过激活交感神经系统释放应激激素激动肝癌细胞β2-AR促进肝癌细胞骨架重塑和EMT。(3)慢性应激通过激动β2-AR介导β-catenin/LEF1/Vimentin信号通路活化调控肝癌细胞发生EMT,促进肝癌细胞侵袭和转移。本课题从心理-神经-内分泌的角度研究慢性应激对肝癌转移的促进作用,揭示了社会心理因素调控肝癌转移的新理论;并对慢性应激介导β2-AR/β-catenin/LEF1/Vimentin信号通路活化促进肝癌细胞侵袭和转移分子机制进行探讨,为探索防治肝癌转移的新策略提供理论基础和实验依据。