目的：通过体外模型，对耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的分子调控机理进行初步研究。方法：1.解剖显微镜下，无菌操作分离获取豚鼠耳蜗血管纹组织，经Ⅰ型胶原酶消化后接种培养，反复多次刮除杂细胞并使用内皮细胞条件培养液对所培养的内皮细胞进行纯化。用免疫组化（SP法）通过内皮细胞特有的Ⅷ因子抗原对所培养的细胞进行鉴定。通过体外培养，获取单层融合的豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞，使用小池技术，建立由内外池构成的耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性体外模型，内池为底部由单层融合的耳蜗血管纹微血管内皮细胞覆盖的Millicell，外池为六孔培养板的培养孔；2.将不同浓度的霍乱毒素分别加入耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性体外模型的内池中，孵育2小时，然后加入牛血清白蛋白或伊文氏兰，再孵育1小时，分别取内外池溶液，进行吸光率检测，按公式：通透分子的通透率=外池溶液的吸光率/内池溶液的吸光率计算牛血清白蛋白或伊文氏兰的通透率，设对照组；3. 将霍乱毒素和速尿分别加入耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性体外模型的内池中，孵育2小时，然后加入牛血清白蛋白或伊文氏兰，依次在不同的时相分别取内外池溶液，进行吸光率检测，按前述方法计算不同时相牛血清白蛋白或伊文氏兰的通透率，绘制牛血清白蛋白和伊文氏兰通过耳蜗血管纹微血管内皮屏障的通透曲线，以研究霍乱毒素和速尿对两条曲线的影响，设对照组；4.用腺苷环化酶激动剂霍乱毒素和<WP=7>耳毒性药物速尿作为处理因素，将其分别与豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞孵育3小时,然后对耳蜗血管纹微血管内皮细胞cAMP和F－actin进行检测,以研究霍乱毒素和速尿对耳蜗血管纹微血管内皮细胞cAMP含量和F－actin分布及含量的影响。设对照组。结果：1. 豚鼠耳蜗血管纹组织块经胶原酶Ⅰ消化，培养24小时，培养瓶内可见部分细胞贴壁伸展，呈短梭形或长圆形。7天后，培养瓶内出现多个由短梭形或钝圆形细胞呈“铺路石状”排列形成的细胞岛。经过反复多次刮除杂细胞并使用内皮细胞条件培养液，细胞形态趋于一致，为短梭形或钝圆形细胞。细胞排列致密时，细胞间隙消失，彼此融合形成致密融合的细胞单层，呈现典型的“铺路石”样外观。所培养的细胞经免疫组化（SP法）鉴定，99%以上细胞胞浆内具有内皮细胞特有的Ⅷ因子抗原，提示为内皮细胞。用所培养的耳蜗血管纹微血管内皮细胞建立通透性体外模型；2. 霍乱毒素能明显增强耳蜗血管纹微血管内皮的屏障功能，使牛血清白蛋白和伊文氏兰的通透率显著降低(P<0.01)；3. 本模型牛血清白蛋白和伊文氏兰的通透曲线都为上升曲线。同对照组曲线相比较，霍乱毒素组曲线明显低于对照组，而速尿组曲线则明显高于对照组，进一步提示霍乱毒素能显著增强耳蜗血管纹微血管内皮的屏障功能，而速尿则能显著减弱耳蜗血管纹微血管内皮的屏障功能；4. 霍乱毒素能使耳蜗血管纹微血管内皮细胞cAMP的含量显著增加(P<0.01)，增加可达2-10倍，且随着霍乱毒素浓度的增大有增多的趋势，内皮细胞F－actin的含量则显著减少(P<0.05)，且核周F－actin减少尤为明显；而速尿作用恰好与之相反，能使耳蜗血管纹微血管内皮细胞cAMP的含量显著减少(P<0.01)，内皮细胞F－actin的含量显著增多(P<0.01)，且核周F－actin增多尤为明显。提示，cAMP和F－actin可能参与了耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的分子调控。结论：本研究表明，cAMP是体外耳蜗血管纹微血管内皮通透性调控的主要分子机理之一。耳毒性药物速尿可能通过cAMP改变耳蜗血管纹微<WP=8>血管内皮的通透性。耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的改变同内皮细胞形状的改变及肌动蛋白丝在内皮细胞中的分布和含量的变化有关，说明这一过程中可能存在着细胞骨架的作用。