目的:关节软骨是运动系统的重要组成部分，人口老龄化引起的关节软骨磨损、退行性变和各种创伤及运动损伤造成的软骨损伤逐渐增多。关节软骨属于透明软骨，软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix， ECM)是其主要组成部分，其为一种形式特别的结缔组织。关节软骨的功能主要包括两个方面，一是减轻关节运动过程中作用于软骨下骨的压力，二是减少关节面的摩擦。因为软骨组织的营养只是来源于关节液，同时也没有血液供应，所以，在软骨组织发生破坏以后，血液或骨髓里的祖细胞无法被激活进入缺损处进行修复，损伤很难自愈。如果没有得到正确的处理，那么骨性关节炎的发生是在所难免的。骨性关节炎是一种慢性退行性疾病，主要在髋关节、膝关节等负重关节多发。它在病理上的改变主要体现在:软骨的骨化退变、关节内游离体的形成、继发性的软骨下骨囊性变、关节边缘骨赘形成、以及骨重塑增多等方面。它以引起关节的退行性变及受累关节的疼痛为特点，目前还没有彻底阻止其进展的方法。骨性关节炎发展的主要因素为关节组织内的慢性炎症以及其渐进性的结构改变。TNF-α，作为一个重要的在骨性关节炎中高表达的细胞因子，它可以通过ERK，p38，JNK，AP-1和NF-κB的转录增加MMP-13的表达。传统的软骨修复方法都不能够逆转骨性关节炎的病程进展，最终会采取人工关节置换的方法来达到缓解症状和恢复功能的目的。　　炎症的分类主要包括细菌性和无菌性两大类。在类风湿性关节炎、老化或者雌激素缺乏等病人的血液中，炎症因子TNF-α的表达量均有不同程度的升高。有些外来物如细菌毒素(如LPS)和细胞碎片等都可以刺激机体产生很多炎症细胞因子（如TNF-α等)，进而NF-κB等炎症反应相关的转录因子被诱导激活，使得机体发生一系列的炎症反应。在骨性关节炎的过程巾，由滑膜分泌的炎性因子对软骨细胞的影响主要体现在对软骨细胞基质的降解上。有体外研究表明，IL-1β和TNF-α能够明显抑制BMSCs的成骨及成软骨分化作用。除此之外，TNF-α还能直接引起大鼠BMSCs的凋亡。　　JNK信号通路可以参与机体的各种生物学反应，主要包括细胞形态维持和细胞骨架构建，同时还有细胞凋亡、细胞恶变以及细胞增殖与分化等。其中缺血/再灌注损伤的主要机制之一就是JNK参与的细胞凋亡作用。JNK信号通路可被表皮生长因子、细胞因子(TNF-α、IL-1)、应激及G蛋白偶联受体等胞外刺激激活。已有研究表明，IL-1可以通过JNK信号通路诱发透明软骨组织中的蛋白多聚糖降解。HebaM等人进一步在小鼠骨性关节炎模型研究中发现，TNF-α、IL-1两种细胞因子都可以激活JNK-2基因进而使得软骨组织中的蛋白多聚糖降解。本研究主要是通过对JNK信号通路的抑制，来改造大鼠的BMSCs，进而探究通过此种方法改造后的BMSCs，在炎症细胞因子TNF-α的作用下的抗凋亡能力及其向软骨分化能力是否有所提高。　　研究方法:1、BMSCs细胞培养、诱导分化及相关鉴定:常规对BMSCs进行培养，视细胞生长情况进行胰蛋白酶消化、传代，铺板后对细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导分化，对成脂分化细胞进行油红染色，对成骨分化细胞进行茜素红染色，对成软骨分化细胞进行阿利新蓝染色。2、Western blot检测各组细胞的p-JNK蛋白表达:经SP600125处理后，利用Western blot检测各组细胞p-JNK蛋白表达的情况。3、MTT细胞活性检测:将BMSCs接种于96孔培养板中，用不同的药物处理细胞后，以MTT法通过OD值反映细胞活性。4、对凋亡细胞的形态进行观察:取对数增长期的BMSCs铺于6孔板培养24 h，之后在各孔内加入不同药物反应，其中阴性对照组不加药物，其余各组加入50 ng/ml的TNF-α，在5％ CO2，37℃恒温箱反应24 h，其中实验组的细胞用10μM的SP600125预先处理1h。之后将6孔板置于倒置显微镜下观察不同处理组之间BMSCs的形态学变化。5、TUNEL及DAPI细胞核染色:利用TUNEL/DAPI对细胞核染色，荧光显微镜下对细胞核形态进行观察。从细胞核形态及颜色两方面反映细胞凋亡情况。正常细胞核无绿色荧光，呈常规椭圆状;凋亡细胞核会呈现出绿色荧光，同时细胞核形态也发生变化，表现出核固缩成团，甚至碎裂溶解。6、通过流式细胞术对细胞凋亡进行测定:利用AnexinⅤ/PI双染法检测处理后细胞早期及晚期凋亡情况。7、Western blot检测细胞凋亡蛋白的表达:利用Western blot检测处理后，细胞P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspass9、cleavedcaspass3等凋亡相关蛋白表达情况。8、Transwell细胞迁移实验:处理后的细胞，用Transwell细胞迁移试验，对细胞的迁移能力进行观察。9、成软骨分化过程中MTT细胞活性检测:取成软骨分化后1天、7天、14天的细胞进行MTT细胞活性检测，通过490 nm处的吸光度值来反映不同时间点的细胞的活性变化。10、实时定量PCR对成软骨分化相关基因的表达进行检测:细胞成软骨分化14天后，提取mRNA，反转录成cDNA后采用实时定量PCR的方法对成软骨相关基因Agc、Sox9进行检测。11、成软骨分化后细胞阿利新蓝染色:于6孔板中对BMSCs进行成软骨分化14天后，PBS洗3次，4％的多聚甲醛固定，PBS洗3次，用阿利新蓝染液染色后，于倒置显微镜下观察不同处理组之间BMSCs的染色情况。12、3D培养法诱导细胞成软骨分化:细胞计数后置于15 ml离心管中，500×g离心5 min，于5％ CO2，37℃恒温箱培养24 h，待细胞成团后，用含有不同药物的成软骨分化培养基进行诱导分化。13、软骨球冰冻切片后阿利新蓝染色:3D培养法诱导不同组的细胞成软骨分化后，细胞固定，OCT包埋，软骨球进行冰冻切片后进行阿利新蓝染色，显微镜下观察照相。14、软骨分化后细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色:取固定透化的细胞标本，加入兔抗鼠Ⅱ型胶原抗体（一抗）稀释液置于4℃冰箱过夜。将标本从冰箱中取出，PBS洗3次，加入FITC标记的山羊抗兔IgG1∶200稀释，置于37℃温箱中60分钟，80％甘油PBS封片，在荧光显微镜下观察。15、Western blot检测成软骨分化蛋白的表达:利用Western blot检测成软骨分化后，细胞Agc、Col2a1成软骨分化相关蛋白及MMP-1、MMP-3、MMP-13等炎症相关蛋白表达情况。　　结果:1、BMSCs体外贴壁生长良好，具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。BMSCs细胞贴壁生长，呈长棱形，漩涡状生长，分布均匀。加入特定的诱导分化培养基后出现相应的形态学变化:成脂分化的细胞内脂滴可以被油红O染成红色，成骨分化后产生的钙结节可以被茜素红染成红色，成软骨分化后的细胞被阿利新蓝染成蓝色。2、SP600125能够有效抑制TNF-α所引起的p-JNK蛋白高表达。Western blot检测所示，相对于阴性对照组TNF-α可以引起p-JNK蛋白的表达增高，在应用了SP600125预处理后，相对于单独应用TNF-α处理组，p-JNK蛋白的表达有所减低。3、SP600125可以增强TNF-α处理后细胞的活性。相对于单独有TNF-α处理组，用SP600125预处理的细胞活性有不同程度的增强，其中以浓度为10μM组，效果最为明显。4、TNF-α处理后细胞出现了凋亡形态学变化，应用SP600125后凋亡程度有所减轻。TNF-α处理后部分细胞固缩，失去原有的纤维样形态，变圆，细胞排列不紧密，贴壁能力下降。在应用SP600125后上述形态细胞有所减少。5、TUNEL/DAPI细胞核染色分析细胞凋亡。TUNEL/DAPI核染色之后于荧光显微镜下对细胞核进行观察。对照组细胞核呈现为正常一致的椭圆形，均匀的蓝色荧光，无绿色荧光。TNF-α处理组细胞核呈现为固缩、碎裂、片状，失去正常核形态，呈绿色荧光。在用SP600125预处理细胞后，细胞核凋亡情况有了明显改善。6、AnnexinⅤ/PI双染法证实SP600125可以增强BMSCs的抗凋亡能力。TNF-α处理组的细胞凋亡率明显高于对照组，但在应用SP600125预处理后，细胞凋亡率有所下降。7、SP600125预处理后细胞的凋亡蛋白表达量相对于单独应用TNF-α处理组有明显减低。Western blot结果显示，在应用TNF-α处理后Clevead-caspase-9和Clevead-caspase-3蛋白的表达出现了相应的上调;同时Bax表达出现明显上调，相反，Bcl-2表达出现明显下调。在应用SP600125预处理后，上述蛋白的变化情况有所减小。8、SP600125可以增强TNF-α处理后BMSCs的迁移能力。Transwell细胞迁移实验显示，与阴性对照组相比，TNF-α处理后的细胞穿过小室的数量明显减少，SP600125预处理后的细胞较单独用TNF-α处理组穿过小室明显增多。9、成软骨分化过程中各组细胞活性无显著差异。在成软骨分化过程中，不同时间点细胞的活性无显著的统计学差异。10、SP600125能提高TNF-α处理后细胞成软骨相关基因Agc、Sox9的表达。实施定量PCR结果显示，Agc和Sox9两个成软骨相关基因在TNF-α出现的情况下表达明显下调，而SP600125处理后的细胞，这两种基因表达情况较单独用TNF-α处理组显著增高。11、较单独用TNF-α处理组相比，SP600125使得细胞被阿利新蓝染色更明显。细胞成软骨分化后形态由原来的长梭形变成多角形或圆形，同时贴壁能力下降，可以被阿利新蓝染成蓝色。同单独用TNF-α处理组相比，SP600125使得细胞被阿利新蓝染色更明显。12、同单独用TNF-α处理相比，加入SP600125后细胞诱导成的软骨球较大。3D培养法诱导成软骨分化结果显示，加入TNF-α后诱导的细胞团形状不规则，体积较阴性对照组小;使用SP600125处理后，细胞团变得更接近球形，同时体积也较独用TNF-α处理组大。13、3D培养法细胞成软骨分化更完全。软骨球冰冻切片后阿利新蓝染色结果显示，总体的阿利新蓝染色更充分。同单独用TNF-α处理组相比，SP600125使得细胞被阿利新监染色更明显。14、用SP600125预处理的细胞Col2a1表达量较单独用TNF-α处理组相比明显增多。免疫荧光结果显示，同阴性对照组相比，用含有TNF-α的培养基诱导分化后，Col2a1在细胞内的表达量明显减低。同单独用TNF-α处理组相比，加用SP600125处理后细胞的Col2a1表达量显著增加。15、较单独用TNF-α处理组，SP600125增加了Agc和Col2a1蛋白表达量，同时降低了MMP-1、MMP-3以及MMP-13的蛋白表达量。Western blot结果显示，TNF-α可以降低Agc和Col2a1两种成软骨相关蛋白的表达量，应用了SP600125后这两种蛋白的表达有所回升。此外，TNF-α可以增加MMP-1、 MMP-3以及MMP-13的蛋白表达量，SP600125的使用使得这些炎症相关蛋白表达量下降。　　结论:1、大鼠BMSCs可以在体外分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。2、SP600125可以有效抑制大鼠BMSCs在TNF-α作用下的p-JNK蛋白表达。3、在TNF-α作用下，SP600125能够使大鼠BMSCs的体外活性增强，同时能够抑制TNF-α诱导BMSCs体外凋亡作用。4、SP600125可以增强TNF-α处理后BMSCs的迁移能力。5、SP600125能提高TNF-α处理后大鼠BMSCs的软骨分化能力。