背景:结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引发的人畜共患传染病。巨噬细胞作为Mtb的主要宿主细胞和靶细胞可通过自噬清除病原菌,有效抑制Mtb在宿主细胞内的增殖。而Mtb则利用多种机制抑制自噬的发生,从而逃避巨噬细胞的免疫杀伤,为自身在胞内增殖创造有利条件。二者相互作用的过程受多种因子调控,其机制十分复杂。受体相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIP3)是一种具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白,作为细胞凋亡和坏死的转化器,在调控细胞命运过程中发挥重要作用。新近研究表明,RIP3可通过多种方式参与调控细胞自噬,从而影响感染性疾病的病程。本项目组前期研究显示,结核分枝杆菌感染可诱导巨噬细胞自噬,同时促进细胞内RIP3的表达,但RIP3是否参与结核分枝杆菌诱导的细胞自噬过程尚不明晰。基于以上研究背景,为探究RIP3是否参与调控BCG(Bacillus Calmette-Guerin)诱导的巨噬细胞自噬过程,项目组开展了如下研究:方法:以RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)为研究对象,通过小干扰RNA技术敲减巨噬细胞内RIP3的表达,同时利用结核分枝杆菌疫苗株BCG(Bacillus Calmette-Guerin)感染细胞。利用透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜、q-PCR和Western blotting等手段,从形态学水平和分子水平检测自噬相关指标,阐明RIP3对BCG诱导的巨噬细胞自噬的调控作用。随后通过雷帕霉素处理来确定RIP3对巨噬细胞自噬的调控是否依赖于mTOR途径,并对RIP3和P62互作及共定位进行进一步研究,通过以上研究得到如下结果:(1)BCG感染可诱发巨噬细胞自噬,自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达量在感染复数为10,感染时间为6小时达到最高。同时BCG感染巨噬细胞6h可极显著上调巨噬细胞内RIP3的表达而siRNA-RIP3可显著下调BCG感染后巨噬细胞内RIP3的表达。(2)siRNA-RIP3可抑制BCG感染巨噬细胞后细胞中自噬体和自噬溶酶体的形成及自噬流的发生;同时siRNA-RIP3显著下调了 BCG感染后巨噬细胞自噬相关因子LC3、ULK1、Beclin1、ATG5、ATG7和ATG12的表达,并导致P62的大量积累,从而阻止自噬的发生。(3)siRNA-RIP3促进了 BCG感染巨噬细胞后mTOR通路上下游因子p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达;同时,在BCG感染过程中,siRNA-RIP3可抑制雷帕霉素诱导的自噬相关因子LC3Ⅱ、ATG5和ATG7的表达。以上结果表明,siRNA-RIP3通过mTOR依赖途径调控BCG诱导的巨噬细胞自噬。(4)免疫共沉淀实验结果表明RIP3与P62存在相互作用,并且BCG感染上调了 RIP3,并促进了 RIP3与P62共定位;进一步研究发现,RIP3、P62可分别与溶酶体标记蛋白LAMP2共定位,而siRNA-RIP3减少了 P62与LAMP2共定位现象。由此可见,BCG感染后RIP3通过与P62互作诱导自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,而si-RIP3则阻滞这一进程,并抑制了自噬的发生。综上所述,BCG可诱导巨噬细胞发生自噬,同时上调RIP3的表达;而siRNA-RIP3可抑制自噬相关蛋白表达,并通过mTOR依赖途径抑制BCG诱发的细胞自噬;此外,siRNA-RIP3可抑制RIP3与P62的互作从而阻滞自噬溶酶体的成熟和自噬的发生。