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目的本研究旨在建立直接从临床标本中扩增人肠道病毒部分VP1区基因及完整VP1区基因的方法,结合该方法分析福建省手足口病其它肠道病毒（非EV71及非CVA16的肠道病毒）分子流行病学特征及病原谱转变的分子机制等;并研究CVA10的致病机制及与EV71的差异性致重症机制。方法建立直接从临床标本中扩增人肠道病毒部分VP1区基因及完整VP1区基因的巣式PCR方法:（1）巣式PCR方法的构建:包括病毒RNA的提取、第一步的RT-PCR、第二步的PCR及相应的引物选择设计;（2）方法灵敏度评价:包括细胞培养传代、病毒分离鉴定及病毒滴度测定,及验证方法的检测下限。福建省手足口病其它肠道病毒分子流行病学研究:（1）采用CVA6与CVA10特异性荧光RT-PCR初筛临床标本中CVA6与CVA10;（2）采用上述建立的直接临床标本中扩增人肠道病毒部分VP1区基因及完整VP1区基因并一代测序,从而获得部分及完整VP1区基因序列;（3）通过细胞培养传代、病毒分离方法等获得病毒分离株;（4）通过Ion torrent S5二代测序平台获得肠道病毒全基因组序列。CVA10与EV71差异性致重症机制研究:（1）人THP-1单核细胞培养传代,及诱导分化成巨噬细胞;（2）CVA10及EV71感染THP-1单核巨噬细胞,采用ELISA方法检测细胞上清中IL-1β;（3）采用NLRP3 si RNA、NLRP3炎症小体抑制剂（格列本脲、高浓度钾离子）构建抑制NLRP3炎症小体的THP-1巨噬细胞模型,q RT-PCR及Western blot检测相关的抑制效率;（4）通过Illumina Next Seq 500二代测序平台对CVA10及EV71感染THP-1单核巨噬细胞后mi RNA进行高通量测序;（5）采用q RT-PCR检测病毒核酸及验证差异性mi RNA。结果建立直接从临床标本中扩增人肠道病毒部分VP1区基因及完整VP1区基因方法,其灵敏度分别为10TCID50/100μl及100TCID50/100μl。福建省手足口病其它肠道病毒分子流行病学研究结果:（1）2011-2018年福建省手足口病其它肠道病毒由人肠道病毒A、B、C及D组中的25种血清型组成;（2）CVA6、CVA10及CVA4感染病例,性别分布与EV71、CVA16一致,即男性比女性更易感;以5岁以下儿童为主,但CVA6与CVA10感染病例的年龄低于EV71、CVA16及CVA4;致重症率从高到低依次为EV71、CVA10、CVA6及CVA16;（3）2008-2018年福建省手足口病病原谱的变化过程概况为2008-2010年“EV71暴发”、2011-2012年“EV71转换过渡至CVA6”及2013-2018年“CVA6暴发”等三个阶段,同时,CVA16、CVA10及CVA4等多种血清型人肠道病毒共同循环流行,而手足口病重症病死率呈现不断下降趋势;（4）2011-2018年福建省CVA6的基因型时间分布变化过程,即从D2基因亚型到D3基因亚型D3a分支的逐渐进化过程;（5）2011-2018年福建省的CVA10的基因型和基因亚型未发生改变,均分布在C2基因亚型;（6）2011-2018年福建省CVA5、CVA10、CVA21及EV68未发现重组现象,其余CVA6等18种血清型均存在疑似种内重组,且重组模式多样,表现为同一个血清型不同分离株存在不同的重组模式,福建省不同血清型分离株之间存在重组,以及福建省一起病毒性脑炎暴发疫情的E30病原参与福建省多个B组肠道病毒血清型的重组。CVA10与EV71差异性致重症机制研究结果:（1）CVA10感染THP-1单核巨噬细胞,引起IL-1β分泌升高,但其IL-1β的表达水平低于EV71;（2）抑制NLRP3炎症小体可降低CVA10感染THP-1巨噬细胞IL-1β的分泌水平;（3）CVA10感染THP-1单核巨噬细胞后其病毒核酸含量低于EV71;（4）CVA10感染THP-1单核巨噬细胞后mi RNA表达谱与EV71存在差异;（5）CVA10感染THP-1单核巨噬细胞后mi R-146a表达水平低于EV71。结论（1）建立了直接从临床标本中扩增测序人肠道病毒部分VP1区基因及完整VP1区基因方法,可更好应用于临床标本中人肠道病毒分子分型和分子流行病学研究。（2）2011-2018年福建省手足口病其它肠道病毒由人肠道病毒A、B、C及D组中的25种血清型组成,其中,CVA6的D基因型,特别是其D3a分支,引起2011-2018年福建省手足口病病原谱的转变与CVA6暴发流行;CVA10的C2基因亚型,引起福建省CVA10流行,但同时可能因其相对稳定,进化变异慢,未发生重组,所以未形成大规模的暴发流行。（3）CVA10感染THP-1单核巨噬细胞通过激活NLRP3炎症小体分泌IL-1β;但其IL-1β的表达水平低于EV71,可能是CVA10感染致重症率低于EV71的重要因素。（4）CVA10感染THP-1单核巨噬细胞的mi RNA表达谱与EV71存在差异;mi R-146a在CVA10的低表达,可能是CVA10感染致重症率低于EV71的重要因素。综上所述,本研究为人肠道病毒的分子分型及分子流行病学研究,提供重要技术手段,为人肠道病毒的分子流行病学及致病机制提供一些新的证据和思路。