荔枝果皮可溶性POD组分的纯化、鉴定及其生化特性研究

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:ljkstar007
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本试验以乌叶荔枝为材料,对果皮中可溶性POD各组分分别进行了分离纯化;对可溶性POD各组分的理化性质进行了研究,对POD催化降解荔枝花色苷进行了探讨;应用串联质谱技术对纯化得到的POD各组分分别进行了部分肽段的氨基酸序列解析;根据质谱结果,克隆获得了编码可溶性POD组分的cDNA全长;对荔枝果皮结合态POD进行了初步的研究。主要结果如下:成熟的荔枝果皮,加入30%PVPP(w/w),采用0.1mol/LTris-HCI(pH8.0)匀浆,过滤离心后得到的POD粗酶液用40%饱和度(NH4)2S04分级沉淀。经过Streamline Pheny1、DEAE-52、Pheny1 Sepharose、Superdex-200柱层析,得到四个组分的POD,命名为A1、A2、B1、B2,通过SDS-PAGE和分子筛层析,确定其表观分子量依次为55.1KD,43.3KD,48.9KD和43.3KD。对四个组分进行酶学特性的测定,得到A1最适反应温度为35℃,A2最适反应温度为30℃,B1与B2在25-50℃温度范围内活性十分稳定且保持最大活性。四组分中A1在pH5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液中活性最大,A2在pH6.0时具有较高活性,B1、B2的最适pH为6.5。对于不同的底物,各组分POD表现出了不同的特性,愈创木酚和ABTS为最适宜底物,4-甲氧基酚、绿原酸、邻苯二酚、表儿茶素、4-甲基邻苯二酚、对苯二酚和抗坏血酸表现出不同的活性,焦性没食子酸和黎芦醇对四组分均无个反应。金属盐离子对四个组分的活性影响不大,当抑制剂DTT终浓度达到1mmol/L时,完全抑制四组分活性;AsA在0.1mmol/L下抑制POD活性20%~50%,终浓度达到1mmol/L时,四组分酶完全失活;半胱氨酸则表现出了对A1活性抑制的特异性。对各组分POD米氏常数的计算中发现,在众多的酚类底物中,(-)-表儿茶素的米氏常数均为最低,表明(-)-表儿茶素可能是可溶性POD的最适内源性底物。另外,四组分还表现出邻苯二酚酶活性(PPO),以邻苯二酚作为底物时,A1和B2的最适反应pH值、温度为7.0、40℃,当pH小于7.0或大于7.5时活性严重损失。相较于对金属离子不敏感的POD性质,当酶表现PPO活性时,1mmol/LMn2+、Cu2+均会使PPO活性显著增强。对纯化的得到的四组分POD进行胶内胰蛋白酶消化和MALDI-TOF MS/MS质谱分析,结果发现在A1、A2中具2个相同的肽段,序列分别为GFDVVDSMK、TLANLNIPAPTDPLQTLQSK;在B1、B2中亦具2个相同的肽段,序列分别为MGNLSPLTGTDGEIR和SVFLSGGPSWSVPLGR。Mascot 检索结果表明,A1、A2 与荔枝 POD(GenBank:DQ408430)相匹配;B1、B2 与 POD2(GenBank:ACI03400)匹配。质谱结果证实,‘乌叶’荔枝果皮可溶性POD组分A1和A2,B1和B2分别为分别为2个不同的cDNA所编码,由于翻译后修饰的差异而形成同工酶。通过3’-RACE和5,-RACE得到编码A1/A2的cDNA全长共1339bp,其中开放阅读框1113bp,编码370个氨基酸。荔枝果皮花色苷采用0.5mol/LHC1浸提,后经过XAD-7、SephadexLH-20进行柱分离纯化。通过HPLC检测并对比标样,确认其最主要成分为矢车菊素-3-0-芸香糖苷。该花色苷在1%蚁酸(pH2.07)中较为稳定,但是在含1mmol/LH202的条件下,POD组分A1、B2能强烈催化其褪色降解反应;在降解反应中,最适反应pH3.0,最适反应温度分别为55℃和45℃,当pH2.07时A1、B2对于矢车菊素-3-芸香苷的Km值分别为16.73mmol/L和17.44mmol/L,在pH3.0时,A1、B2对于矢车菊素-3-芸香苷的Km值分别为13.34 mmol/L和12.4mmol/L。论文还首次对荔枝果皮结合态POD的组分及其在果实生长发育过程中的变化进行了研究。
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