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随着斑马鱼(Danio rerio)基因组测序工作的完成,研究人员发现斑马鱼与人类(Homo sapiens)基因同源性较高,针对这一特点,研究人员构建了多种人类疾病的斑马鱼模型,用于探究疾病发生机制。基因编辑技术的应用促进了斑马鱼基因功能研究的发展,先进的基因编辑技术CRISPR/Cas9系统,因其简单高效正广泛被应用。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼lncRNA基因启动子区以及将dCas9基因敲入斑马鱼基因组。本文主要的研究内容如下：1、为了研究Nondret002679在斑马鱼胚胎各时期以及成年后各组织中的表达规律,首先收集0 hpf(合子期)、3 hpf(囊胚期)、6 hpf(原肠期)、12hpf(体节期/5-体节)、24hpf(咽囊期)及48hpf(孵化期)的斑马鱼胚胎提取总RNA,逆转录为cDNA,采用荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测Nondmt002679的表达规律。同时收集成年斑马鱼的心脏、肝脏、睾丸、卵巢、肌肉、尾鳍7组织样,同样采用RT-qPCR方法检测Nondret002679的表达规律。结果显示,24 h时Nondret002679表达量是O h的457倍(p<0.01),48 h时是O h的1066倍(p<0.01),前4时期Nondret002679的表达无差异(p>0.05)。Nondret002679在大脑中高表达,是心脏的248倍,(p<0.01),其他组织与心脏相比表达量增加,但差异不显著(p>0.05),因此表现出组织特异性。这些结果为进一步研究Nondret002679的生物学功能提供依据。2、利用CRISPR/Cas9系统敲除Nondret002679基因的预测启动子区以沉默其表达。首先根据预测启动子区上下游序列设计靶向不同位点的向导RNA(guide RNA) gR1、 gR2、 gR3、 gR4、 gR5和：gR6 gRNA。将gRNAs与Cas9 mRNA一起显微注射到斑马鱼卵中。PCR鉴定28尾2月龄斑马鱼发现,11尾发生敲除,敲除率为39%。将启动子区敲除的F0杂合斑马鱼繁殖,获得33尾F1代,经鉴定有6尾F1斑马鱼启动子区缺失,其中3尾为启动子区纯合缺失。选启动子区敲除的F0杂合斑马鱼5尾,利用RT-qPCR方法分析Nondret002679转录情况,有4尾斑马鱼Nondret002679转录水平下调,这表明启动子区敲除对基因转录有影响。3、利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲入,建立dCas9定点敲入斑马鱼基因组模型。首先设计dCas9 donor载体,根据dCas9 donor同源臂长度不同分522 donor和1092 donor两组。522 donor组成功敲入效率为25.6%,纯合敲入斑马鱼占该组敲入斑马鱼的比例为40%；1092 donor组敲入效率为20.5%,纯合敲入斑马鱼占该组敲入斑马鱼的11%。最后用RT-PCR方法分析dCas9的表达情况,结果显示其可在斑马鱼体内表达,成功构建了dCas9斑马鱼模型,该研究建立的模型可为研究基因功能提供重要的工具。综上所述,CRISPR/Cas9系统可高效敲除lncRNA;基因的启动子区,同时启动子区敲除的杂合斑马鱼lncRNA基因转录水平明显下调,为研究lncRNA功能提供了有效的基因编辑工具。dCas9斑马鱼模型可用于激活或抑制感兴趣基因的表达,为研究基因功能提供了有用的工具。