论文部分内容阅读
第一部分：人及大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定 神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)，在一定条件下能定向分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞，故理论上神经干细胞具有修复神经系统疾病及损伤的能力。但在其应用于临床之前，首先必须分离、培养并获得相对纯化的神经干细胞，掌握其自我繁殖、更新、传代、分化等规律，所用培养液和添加剂应尽最大努力保持NSCS的原始活力。本研究取孕16天SD大鼠胚胎大脑皮层组织，或新生3天的SD大鼠海马组织，孕3月人胚胎大脑皮层组织或孕4.5～7月人胚胎海马组织，通过无血清培养技术，在体外进行传代培养获取神经干细胞，并对其分裂、分化等特点进行研究和比较。结果表明：①在适宜的浓度体外培养条件下，NSCs能形成典型的神经干细胞克隆球，Vimentin免疫荧光染色阳性，单靠丝裂原刺激或NSCs自我调节和分化诱导，不会产生典型的终末分化的成熟神经细胞；②海马源性的NSCs维持干细胞特性的时间更长，生物学特性更优；③传至第2～3代的NSCs尚未分化时移植最佳；④体外培养的NSCs能自我调控分化为神经元、星形胶质细胞、O2少突胶质细胞、雪旺氏细胞染色阳性克隆球和前体细胞；⑤各种子代克隆球和细胞存在广泛的突触联系；⑥NSCs与OECs联合培养时，不需丝裂原刺激即能形成克隆球，获得大量Vimentin、GFAP、MAP2、O2、p75NGFR、GFAP、S-100、Synaptosis、Vimentin、Tau(Tau只有人HNSCs+HOECs联合培养时出现阳染)染色阳性的克隆球和细胞；⑦脊髓研磨后的上清液刺激神经干细胞向神经元方向分化，但并不出现终末分化；⑧本研究培养条件不利于成纤维细胞、O4生长。 第二部分：人及大鼠嗅鞘细胞的分离培养及鉴定 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells／glials，OECs／OEGs)是使中枢神经系统轴突再生的最强有力细胞。脊髓损伤后轴突脱髓鞘，胶质增生不利于轴突再生，然而近十年来动物试验和临床研究证实OECs移植治疗脊髓损伤可取得较好的疗效。分离、培养、获得相对纯化的OECs是关键。本研究采用无血清培养技术、对嗅鞘细胞理化特性影响较小的纯化方法进行定量培养，并进行相关鉴定。本研究证实：①无血清体外培养条件能够满足OECs短期体外培养要求，培养第15天是OECs的最佳移植时机，其中HOECs以3～6×10~6／ml的浓度培养时生长状态神经干细胞、嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究中文摘要良好，具有临床应用价值;②嗅鞘细胞可形成克隆球，具有传代和分化能力，培养巧天后开始长出轴突并开始分化，但仍保留某些神经干细胞的特点，尚未产生典型的终末分化的成熟神经细胞;③阿糖胞营法去除成纤维细胞，简单易行，OECs纯度可达90%以上;④贴壁的嗅鞘细胞发出大量轴突反复分支、形成网络;⑤HOECS 04抗体(一)，而ROECS有大量细胞04抗体(+);⑥NSCS与OECs联合培养时，不需丝裂原刺激即能形成克隆球，获得大量Vimentin、GFAP、MAPZ、02、p75NGFR、GFAp、S一100、Syn即tosis、Vimentin、几u(丁hU只有人HNSCs+HOECs联合培养时出现阳染)染色阳性的克隆球和细胞;⑦嗅球可能存在p75NGFR、GFAP(+)或5100(+)类型的两种嗅鞘细胞;⑧本研究培养条件不利于成纤维细胞生长。第三部分:大鼠神经千细胞移植治疗陈旧性脊髓挫伤的实验研究 尽管NSCS的体外培养、分化和鉴定已取得丰硕的成果，但有关NSCS移植治疗脊髓损伤的实验研究尚显不足。本研究参照Allen方法制成大鼠陈旧性脊髓挫伤动物模型，将传至第二代的RNSCS以1 x 10”/L采用立体定向技术移植入大鼠脊髓挫伤区，采用下几rlov评分、斜板试验、爬梯试验、CBS联合评分、电生理检查、磁共振检查、HRP神经示踪、HE染色、透射电镜观察、免疫组化检测和图像分析等方法研究RNSCS移植后大鼠的功能恢复和RNSCS在脊髓内的分布、分化。本研究证实:①大鼠脊髓挫伤后有一定的自我功能恢复，RNSCs移植可明显改善大鼠的感觉、自主运动功能和膀肤自主排尿功能;②RNSCS植入陈旧性挫伤脊髓后可检测到Vimentin染色阳性细胞和克隆球，仍有部分RNSCs保持神经干细胞的特征;③BrdU追踪结果示移植入脊髓内的RNSCS至少向头、尾侧迁移1.scm;④免疫组化阳性面积分析示RNSCS移植后主要分化为神经元、雪旺氏细胞和少突胶质细胞，星形胶质细胞极少;⑤免疫组化阳性面积分析示RNSCS移植后各种细胞形成广泛的突触联系，成纤维细胞数量较少;⑥电镜证实RNSCs能够在脊髓内存活，细胞内存在大量的粗、滑面内质网、核糖体、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、脂滴、突触小泡，与脊髓组织融合良好，移植后髓鞘再生良好、轴突外包绕有胞浆丰富的雪旺氏细胞和少突胶质细胞;⑦SEP及MEP的检测表明RNSCS移植后挫伤脊髓的感觉、运动神经传导通路己恢复;⑧HRP神经示踪显示示踪剂经神经轴突运输穿过脊髓挫伤区域;⑨大鼠脊髓损伤神经干细胞、嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究中文摘要磁共振表现与人类相似;⑩使用高浓度、小体积HNSCS移植、局部降温、脊髓表面浸润麻醉、立体定位仪和较细的穿刺针应成为临床神经干细胞脊髓内移植的原则。