多形性胶质母细胞瘤是成人最常见且恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤之一,其发病率约为3/100,000,在美国每年的确诊人数约为23,000人。 WH02007中枢神经系统肿瘤分类标准将其定义为恶性程度最高级别的IV级肿瘤。受发病部位及其高度侵袭性特点所限,手术治疗很难确定肿瘤边界并全部切除,即使达到肉眼全切并结合术后高强度放射治疗和化学治疗,胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仅有12至15个月。因此,针对多形性胶质母细胞瘤的新治疗方案一直是临床医师和肿瘤学家研究的热点。近年来,随着对肿瘤细胞的异常高增殖性在胶质母细胞瘤的发病机制中的重要作用的发现,基因治疗越来越引起大家的关注,并在一系列临床前实验中取得了一定进展。然而,目前仍未发现合适的治疗靶点。在调节细胞增殖的细胞因子中,高迁移率蛋白家族A2(High mobility group A2,HMGA2)被认为是起关键作用的因子之一。高迁移率蛋白家族(High mobility group proteins, HMGs)属于已知成员最多且研究较为完善的非组蛋白质染色体蛋白家族。HMGs具有分子量小、功能强大等特点,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移速率而得名。HMGs主要包括HMGA、HMGB和HMGN。HMGA又主要包括HMGA1和HMGA2,其中,HMGA2是目前研究最为广泛和受关注程度最高的成员。HMGA2可以通过其特有的AT结合区域与DNA结合并通过改变染色体结构调节DNA的转录。HMGA2在胚胎组织中广泛表达,在成人体内所有分化成熟的组织,包括心脏、脑组织、肝脏、胰脏、各种血细胞和淋巴细胞中几乎无表达或仅有微量表达。然而目前发现HMGA2在多种人类肿瘤尤其是恶性肿瘤中几乎都有表达,例如甲状腺癌、直肠癌和乳腺癌等。并且HMGA2与肿瘤的增殖性以后患者的恶性预后密切相关。RNA干扰技术主要包括双链RNA(dsRNA)和短发夹RNA (ShRNA),是基因工程学自1998年发现基因沉默现象后兴起且日益成熟的基因沉默技术。此项技术的应用可以高效稳定特异地抑制目标基因的表达,从而达到针对目的基因理想的沉默效果。目前,RNA干扰技术特别是shRNA已被成功应用于基因功能研究、癌症等疾病的发病机理和基因治疗等生命科学领域。本研究目的是：首先,检测HMGA2在成人正常脑组织及各WHO病理分级恶性胶质瘤包括胶质母细胞瘤中的蛋白表达,探讨HMGA2与恶性胶质瘤细胞增殖性的相关性以及它们之间的内在联系,并通过随访和生存分析探讨HMGA2高表达与胶质母细胞瘤患者预后的相关关系。然后,通过设计在胶质母细胞瘤细胞中稳定高效表达的慢病毒介导的靶向HMGA2的ShRNA载体,研究该重组载体对于胶质母细胞瘤细胞HMGA2的干扰效果,并进一步明确干扰前后胶质母细胞瘤细胞的增殖及侵袭能力变化,以及通过动物体内实验研究HMGA2抑制胶质母细胞瘤生长速率的影响,以期探讨HMGA2是否可成为未来进行胶质母细胞瘤基因治疗研究的有效靶点。的增殖性以后患者的恶性预后密切相关。RNA干扰技术主要包括双链RNA(dsRNA)和短发夹RNA (ShRNA),是基因工程学自1998年发现基因沉默现象后兴起且日益成熟的基因沉默技术。此项技术的应用可以高效稳定特异地抑制目标基因的表达,从而达到针对目的基因理想的沉默效果。目前,RNA干扰技术特别是shRNA已被成功应用于基因功能研究、癌症等疾病的发病机理和基因治疗等生命科学领域。本研究目的是：首先,检测HMGA2在成人正常脑组织及各WHO病理分级恶性胶质瘤包括胶质母细胞瘤中的蛋白表达,探讨HMGA2与恶性胶质瘤细胞增殖性的相关性以及它们之间的内在联系,并通过随访和生存分析探讨HMGA2高表达与胶质母细胞瘤患者预后的相关关系。然后,通过设计在胶质母细胞瘤细胞中稳定高效表达的慢病毒介导的靶向HMGA2的ShRNA载体,研究该重组载体对于胶质母细胞瘤细胞HMGA2的干扰效果,并进一步明确干扰前后胶质母细胞瘤细胞的增殖及侵袭能力变化,以及通过动物体内实验研究HMGA2抑制胶质母细胞瘤生长速率的影响,以期探讨HMGA2是否可成为未来进行胶质母细胞瘤基因治疗研究的有效靶点。第一部分HHGA2在恶性胶质瘤中的表达及与生物学行为和预后的关系目 的HMGA2是高迁移率蛋白家族非常独特的成员,其基因在肿瘤中的表达增加与多种肿瘤细胞的增殖性和患者恶性预后关系密切。本研究目的是检测HMGA2基因在正常脑组织和恶性胶质瘤中的蛋白表达,并探讨HMGA2与恶性胶质瘤增殖性和侵袭性的相关性；HMGA2与MMP-2和MIB标记系数(MIB-LI)之间的联系以及HMGA2与胶质母细胞瘤患者预后的相关关系。方法1.标本收集2010年10月-2013年5月期间山东省立医院神经外科的原发恶性胶质瘤手术标本78例以及正常脑组织(取自脑内血肿清除术患者)7例,其中女性41例(年龄21-78岁,平均年龄43.3±4.3岁),男性37例(年龄16-83岁,平均年龄44.5±3.5岁)。恶性胶质瘤患者包括星形细胞瘤27例(WHO II级),间变性星形细胞瘤25例(WHO III级),多形性胶质母细胞瘤26例(WHO IV级)。所有病例诊断均由术后的病理证实,并得到山东省立医院病理科的诊断。所有患者术前均未接受手术或者放化疗,星形细胞瘤患者术后未行放化疗,间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤患者术后均接受放化疗。手术标本部分保存于4%多聚甲醛,部分于-80’C保存以提取mRNA和蛋白质。2. 免疫组织化学染色方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(S-P)法,在标准实验流程下操作,检测HMGA2、MMP-2和Ki-67蛋白在正常脑组织和不同WHO分级恶性胶质瘤中的表达,以及他们之间的相关性。3.结果判定标准根据半定量免疫组织化学法评价HMGA2反应阳性细胞显色比例和强度。在光学显微镜高倍视野(×400)下,每张切片随机选择5个视野进行观察,计数每200个肿瘤细胞中免疫反应阳性的细胞所占百分比。每张病理切片分别有4名实验者在双盲的前提下单独进行评价。对于有分歧的结果,由实验者在双头显微镜下重复评价,直至达到一致。HMGA2表达评估：强阳性(+++)：阳性细胞比例大于65%或显色深(深棕褐色)；中度阳性(++)：阳性细胞比例介于30%至65%之间或染色略深(黄褐色)；弱阳性(+)：阳性细胞比例小于30%或显色浅(浅黄色)；阴性(-)：无阳性细胞染色。4.测定HMGA2、MMP-2和Ki-67 mRNA水平和蛋白表达量提取组织中总mRNA并进行逆转录反应,采用实时荧光定量(qRT-PCR)法检测7例正常脑组织和29例恶性胶质瘤组织中HMGA2、MMP-2和Ki67等目的基因的mRNA表达情况。提取组织中总蛋白,使用Western blot法检测HMGA2蛋白表达。5.生存分析将胶质母细胞瘤患者根据免疫组织化学染色结果进行分组：强阳性(+++)和中度阳性(++)为强表达组,弱阳性(+)和阴性(-)为弱表达组。对两组患者进行随访并进行生存分析。6.统计学处理用Fisher精确检验分析HMGA2在不同WH0分级恶性胶质瘤中的表达情况。Spearman等级相关分析用于检验HMGA2与MMP-2、Ki-67以及患者年龄和性别的关系。Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并应用log-rank法进行生存分析。所有统计学处理应用SPSS(19.0版本)统计学软件进行分析。设定P<0.05有统计学意义。结果HMGA2在正常脑组织中无表达,在恶性胶质瘤中可见强弱不等的细胞核着色。HMGA2在胶质瘤组织中总的阳性(率)为92.3%(72/78)。HMGA2与胶质瘤恶性程度存在显著性差别：在间变性星形细胞瘤(P=,037)和胶质母细胞瘤中(P=.007)的表达高于星形细胞瘤,然而在间变性星形细胞瘤与胶质母细胞瘤间未发现明显差别(P-.862)。HMGA2的表达与Ki-67(r=0.415, P<.01)和MMP-2(r=0.363,P<.01)存在相关性,但是未发现其与患者年龄(r=-0.073,P=.525)和性别(r=0.415, P<.01)存在相关关系。另外,qRT-PCR结果显示HMGA2 mRNA在间变性星形细胞瘤(1.98倍,P=.029)和胶质母细胞瘤(2.56倍,P<.01)中的表达高于星形细胞瘤,然而在胶质母细胞瘤与间变性星形细胞瘤间未发现明显差别(1.29倍,P=.118)。 HMGA2 mRNA表达与MMP-2(r=0.432,P=.010)和Ki-67(r=0.386,P<.039)之间存在相关关系。Western blot结果显示HMGA2蛋白在间变性星形细胞瘤(P<.01)和胶质母细胞瘤(P<.01)中的表达高于星形细胞瘤,在胶质母细胞瘤中的表达也显著高于间变性星形细胞瘤(P=.028)。在正常脑组织中见微量表达。HMGA2高表达组胶质母细胞瘤患者的预后差于低表达组(P<.05)。结论1.HMGA2在正常脑组织中几乎无表达。2.HMGA2在不同WHO病理级别恶性胶质瘤中的表达有显著性差异,HMGA2的表达与WHO分级相关,同时HMGA2与MMP-2和Ki-67的表达间的相关性存在统计学意义,提示HMGA2与胶质瘤增殖性和侵袭性存在相关关系,HMGA2免疫组织化学染色有助于不同恶性胶质瘤的诊断。3.在胶质母细胞瘤患者中,HMGA2高表达组患者的生存预后差于低表达组,提示HMGA2表达可以作为多形性胶质母细胞瘤患者的有效临床预后指标。色有助于不同恶性胶质瘤的诊断。3.在胶质母细胞瘤患者中,HMGA2高表达组患者的生存预后差于低表达组,提示HMGA2表达可以作为多形性胶质母细胞瘤患者的有效临床预后指标。第二部分设计合成并筛选针对HMGA2有效的ShRNA慢病毒载体目 的设计并合成3组靶向HMGA2基因的ShRNA载体,进行慢病毒包装和提取,并验证干扰效率,筛选出其中2组有效的慢病毒载体,为下一步的研究做准备。方法1.设计合成ShRNA载体并进行慢病毒包装运用公众网站设计软件,靶向人类INGA2靶基因序列,设计3组ShRNA载体,并验证其特异性,分别编号为1#,2#,3#；1组阴性对照空白载体,编号为0#。然后进行测序比对。结果显示四组载体均被构建成功,测序结果证实无误。应用工具细胞株(人类胚胎肾细胞株HEK293T)进行慢病毒包装并离心提取包装成功的慢病毒颗粒,然后进行病毒滴度测定。2.分别利用ShRNA慢病毒载体1#、2#转染胶质母细胞瘤细胞株(U251细胞)培养生长状态良好的目的细胞(即U251细胞),转染前一天将目的细胞分入6一孔培养板培养,转染当天按实验设计的组别分别利用shRNA载体1#、2#和对照空白载体0#进行胶质母细胞瘤细胞的转染实验。3.嘌呤霉素筛选稳定的转染U251细胞株将细胞稀释到1000个细胞/ml,在0.2μg/ml-5 μg/ml的嘌呤霉素浓度范围内进行筛选,选择出在10-14天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度(1 μg/ml)来进行下一步的筛选试验。在转染24小时之后开始加嘌呤霉素(1μg/ml)进行筛选。随着细胞代谢,嘌呤霉素的浓度和活性会逐渐下降,因此每3-5天更换一次含嘌呤霉素的筛选液。荧光显微镜下观察GFP表达情况,14天后,即可筛选出稳定转染的细胞株,并后续置于含嘌呤霉素0.2μg/ml的培养液中继续培养。4.验证沉默目的基因效果,筛选有效慢病毒载体。选出转染效率为90%左右的组,采用qRT-PCR和western blot的方法检测HMGA2基因的mRNA和蛋白质表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果,筛选出1组有效载体。结果1.在3组实验组shRNA载体中,1#、2#、3#转染效率分别为89.4±6.5%、93.6±5.7%、78.6±12.3%；阴性对照空白载体0#的转染效率为96.1±5.4%。2.3个靶点均对HMGA2有沉默效果。与阴性对照载体0#对比,实验载体1#,2#,3#沉默效率分别为78.3%、82.4%、50.6%。综合转染效率与沉默效果,1#、2#载体为理想靶点,我们在其中选取了载体1#进行下一步实验。结论1_本部分实验成功设计并构建了3组特异性靶向人类HMGA2基因的ShRNA慢病毒载体,病毒滴度较高,可以满足下一步的实验要求。2.从3组重组载体中,根据靶向基因的mRNA和蛋白质沉默效率,筛选出2组靶向HMGA2的高效率慢病毒载体,为下一步靶向人胶质母细胞瘤U251细胞株的HMGA2基因进行转染沉默提供了可靠有效的实验基础。HMGA2基因的mRNA和蛋白质表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果,筛选出1组有效载体。结果1.在3组实验组shRNA载体中,1#、2#、3#转染效率分别为89.4±6.5%、93.6±5.7%、78.6±12.3%；阴性对照空白载体0#的转染效率为96.1±5.4%。2.3个靶点均对HMGA2有沉默效果。与阴性对照载体0#对比,实验载体1#,2#,3#沉默效率分别为78.3%、82.4%、50.6%。综合转染效率与沉默效果,1#、2#载体为理想靶点,我们在其中选取了载体1#进行下一步实验。结论1_本部分实验成功设计并构建了3组特异性靶向人类HMGA2基因的ShRNA慢病毒载体,病毒滴度较高,可以满足下一步的实验要求。2.从3组重组载体中,根据靶向基因的mRNA和蛋白质沉默效率,筛选出2组靶向HMGA2的高效率慢病毒载体,为下一步靶向人胶质母细胞瘤U251细胞株的HMGA2基因进行转染沉默提供了可靠有效的实验基础。第三部分慢病毒介导RNA i沉默HMGA2基因对胶质母细胞瘤细胞增殖及侵袭能力的影响目 的利用构建好的高度特异性和转染率的携带靶向HMGA2 ShRNA的慢病毒载体1#转染人胶质瘤细胞系U251,并通过嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,研究它们介导RNA干扰对人多形性胶质母细胞瘤细胞株U251增殖和侵袭的影响及其意义。方法1.CCK-8检测细胞增殖水平培养生长状态良好且已稳定转染胶质母细胞瘤细胞(U251细胞)。按实验设计的分组(空白对照,阴性对照以及阳性)情况,将细胞分入96-孔培养板培养。第2天后每24小时进行一次CCK-8分析,检测对RNAi靶点有效干扰后的胶质母细胞瘤细胞增殖水平变化。2.小室结合基底胶实验检测U251细胞的细胞侵袭培养生长状态良好且已稳定转染胶质母细胞瘤细胞(U251细胞)。按实验设计的分组(空白对照,阴性对照以及阳性)情况,进行铺matrigel胶的小室实验分析,检测对RNAi靶点有效干扰后的胶质母细胞瘤侵袭能力的变化。3.小室实验检验U251细胞株的细胞迁移能力。培养生长状态良好且己稳定转染胶质母细胞瘤细胞(U251细胞)。按实验设计的分组(空白对照,阴性对照以及阳性)情况,进行小室细胞迁移实验分析,检测对RNAi靶点有效干扰后的胶质母细胞瘤侵袭能力的变化。4. Western blot检验MAPK信号通路关键蛋白变化将转染靶向HMGA2的ShRNA慢病毒载体的稳定转染U251细胞株、转染阴性载体的U251细胞株和正常对照组U251细胞株进行蛋白质提取,分别利用Western blot实验检测Erk、Jnk和p38蛋白质的变化以及磷酸化蛋白质的变化。结果1.CCK-8检测细胞增殖能力实验结果表明,实验组慢病毒载体1#的增殖抑制率(IR)分别为45.2%和40.3%,与阴性对照组和空白对照组相比差异有显著性(P<0.05),这一结果提示在HM6A2被沉默后,胶质母细胞瘤细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力明显被抑制。2.通过小室侵袭方法检测U251细胞侵袭性,结果显示两个慢病毒载体组对照组比较,在沉默HMGA2基因后,胶质母细胞瘤细胞群体中,侵袭能力明显降低(P<0.05)。3.通过小室迁移方法检测U251细胞侵袭性,结果显示两个慢病毒载体组与对照组比较,在沉默HMGA2基因后,胶质母细胞瘤细胞群体中,迁移能力明显降低(P<0.05)。4. Western blot实验结果显示,Jnk蛋白质和p38MAPK蛋白质相应的磷酸化蛋白降低,而Erk蛋白的磷酸化蛋白p-Erk蛋白表达升高。结论1. HMGA2基因对于胶质母细胞瘤细胞的生长和增殖能力具有重要作用；特异性沉默HMGA2基因能引起人胶质母细胞瘤细胞生长周期迟缓。2. HMGA2基因对于胶质母细胞瘤细胞的侵袭性和迁移性同样具有重要作用；特异性沉默HMGA2基因能有效降低人胶质母细胞瘤细胞株U251的侵袭能力和迁移能力。3.Jnk和p38MAPK信号通路可能是HMGA2侵袭性和增殖性相关的关键蛋白。4.RNA干扰技术在未来的胶质母细胞瘤基因治疗的研究方面具有非常光明的应用价值。HMGA2基因能够作为胶质母细胞瘤基因治疗的有效靶点。移能力。3.Jnk和p38MAPK信号通路可能是HMGA2侵袭性和增殖性相关的关键蛋白。4.RNA干扰技术在未来的胶质母细胞瘤基因治疗的研究方面具有非常光明的应用价值。HMGA2基因能够作为胶质母细胞瘤基因治疗的有效靶点。第四部分超声微泡介导的靶向HMGA2基因的RNAi慢病毒载体抑制裸鼠胶质母细胞瘤生长的实验研究目的裸鼠在体实验验证靶向HMGA2基因的慢病毒介导的RNAi对胶质母细胞瘤生长的抑制作用,并探讨超声微泡技术辅助介导基因转染效率的有效性。方法接种U251细胞于24只BALB/C裸鼠皮下并成瘤后,随机将其分为4组,每组分别为6只。带皮下肿瘤模型建瘤成功后,根据实验目的,三个组别分别为超声微泡+靶向HMGA2的慢病毒介导的RNAi (MB+ShRNA)组、单纯慢病毒组(LV)组、单纯超声微泡(MB)组和空白对照(NC)组。MB+ShRNA组每只裸鼠注射慢病毒载体/微泡混合液400gL(含2.5×1010u慢病毒),MB组每只裸鼠注射阴性病毒载体/微泡400μL,LV组每只裸鼠注射慢病毒载体400 μL, NC组每只裸鼠注射D-Hanks液40091。注射实验试剂后立即在瘤体表面皮肤涂以超声耦合剂,并给予超声辐射,用2.5 MHz超声波,强度2.0W/cm2,每次30s,间隔30s,共计2次60s照射。每3天用游标卡尺测量皮下肿瘤长径(a)及短径(b)变化,肿瘤体积根据公式V=π ab2/6计算。15天后采用颈椎脱位法处死小鼠,取瘤并称重。结果1.肿瘤的体积、瘤重与抑瘤率(1) MB+ShRNA组、MB+组与NC组动态观察至成瘤后第15天,裸鼠皮下种植瘤体积分别为181.7±24.61mm3,303.3±31.44mm3,298.7±26.93mm3。方差分析合并LSD post hoc法两两比较MB+ShRNA组与其他两组有明显差异(p<0.01)。表明IB+ShRNA组裸鼠皮下种植瘤体积较其他两组有明显减小。(2)对MB+ShRNA组、MB组与NC组进行动态观察至成瘤后第15天,皮下种植瘤重量分别为0.63-0.09g,1.62±0.17g,1.74±0.26g。Tukey法两两比较,结果显示MB+ShRNA组瘤重较其他两组有明显差异(p<0.01),MB+ShRNA组裸鼠皮下种植瘤与其他两组相比瘤重明显减轻。结 论1.本实验成功构建人胶质母细胞瘤U251皮下种植瘤的裸鼠模型。2.实验中成功利用超声联合微泡液辅助介导了慢病毒载体转染U251人胶质母细胞瘤的裸鼠皮下种植瘤模型。3.实验结果验证了体内环境下超声联合微泡液辅助介导靶向HMGA2的ShRNA慢病毒载体转染胶质母细胞瘤可以有效抑制肿瘤的生长。