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背景:包括 IgA肾病在内的系膜增生性肾炎( Mesangial Proliferative Glomerulo-nephritis, MesPGN)是一种免疫炎症相关性疾病,是我国最常见的慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD),是导致慢性肾衰竭、尿毒症的主要原发病。在我们前期的研究中发现,MAX作用因子1(MAX interactor1, Mxi1)在抗Thy1肾炎模型大鼠中存在明显变化,主要表现为:在系膜增殖期表达降低,增殖恢复期表达逐渐回升,提示这一因子在疾病病理过程中发挥作用。肾小球肾炎是一种自身免疫性疾病,主要与免疫介导的炎症反应有关。在抗Thy1肾炎模型基因表达谱中,在模型建立早期多种免疫炎症相关因子表达明显增多,在模型恢复期表达恢复到正常水平,提示免疫炎症相关因子与系膜增生性肾炎发生发展密切相关。 目的:利用 Mxi1基因敲除小鼠(Mxi1-/-)和野生型小鼠(Mxi1+/+)建立小鼠系膜增生性肾炎模型,对比观察不同类型小鼠病理表型的变化,重点关注Mxi1基因缺失后模型的改变以及免疫炎症因子的变化趋势。而后利用RNAi技术在体外进一步研究Mxi1基因缺失后影响系膜细胞的相关机制。 方法: 1.采用尾静脉注射竹叶青蛇毒素的方式利用 Mxi1基因敲除小鼠和野生型小鼠建立系膜增生性肾炎(Habu肾炎)模型,小鼠遗传背景为:FVB/N。样本取材时间点分别为模型建立的第0(Control),1,3,7和14天,血清样本送至临检科进行生化指标检测;组织样本利用 PAS染色观察两种基因型 Habu肾炎模型小鼠病理在各个时间点的病理表型同时进行肾小球内有核细胞计数;利用免疫组织化学染色方法对肾小球内PCNA表达变化进行对比观察;利用Western blot法和TUNEL染色方法检测肾组织内细胞凋亡水平;利用定量PCR和Western blot法检测相关免疫炎症因子CXCL10的表达,同时利用免疫组织化学染色法对 CXCL10的表达在肾组织内的表达进行定位;利用Western blot法检测调控CXCL10表达的信号通路TLR4-IRF3相关蛋白的表达水平。 2.利用RNAi技术在体外干预小鼠系膜细胞Mxi1基因表达,观察Mxi1基因缺失后免疫炎症相关因子CXCL10表达变化以及细胞生存的影响。 3.利用小鼠抗CXCL10抗体中和Mxi1基因失活细胞内表达的CXCL10后,观察细胞凋亡情况。 4.利用RNAi技术干扰IRF3表达,观察TLR4-IRF3通路被抑制后CXCL10表达变化以及细胞生存的影响。 5.采用尾静脉注射竹叶青蛇毒素的方式建立不同遗传背景小鼠系膜增生性肾炎模型,两种小鼠品系分别为:C57BL/6和FVB/N。病理取材时间点分别为模型建立的第0,1,3,7,14和21天,对比观察各时间点的病理变化及生化指标;利用Western blot法和TUNEL染色法检测肾组织内细胞凋亡水平;利用免疫组织化学染色方法对肾小球内PCNA表达变化进行对比观察。 结果: 1.对 Mxi1基因敲除小鼠和野生型小鼠 Habu肾炎模型组小鼠进行对比观察发现:FVB/N野生型小鼠(Mxi1+/+)和基因敲除小鼠(Mxi1-/-)存活率基本一样;生化指标检测结果提示两种小鼠均没有出现肾功能异常;在病理表型方面,Mxi1+/+模型小鼠在模型建立早期系膜溶解病变较轻且不典型,而Mxi1-/-小鼠则呈现典型的系膜溶解表型,肾小球内有核细胞数明显少于对照组小鼠,活化的caspase3表达增高以及TUNEL染色结果提示Mxi1-/-Habu肾炎模型小鼠肾组织细胞凋亡水平高;在系膜细胞增殖的高峰期两种基因型小鼠的病理表型没有明显差异;对两种小鼠免疫炎症相关因子CXCL10的检测发现这因子在两种小鼠肾组织内呈现不同的变化趋势;Mxi1-/-小鼠肾脏内TLR4-IRF3通路活化。 2.体外采用 RNAi技术干扰小鼠系膜细胞内 Mxi1的表达后,细胞凋亡比例明显上升,CXCL10表达明显升高,Mxi1失活诱导了CXCL10表达;RNAi干扰Mxi1的同时利用抗小鼠CXCL10抗体中和细胞内的CXCL10可以降低活化的 caspase3的表达,减少凋亡细胞数;RNAi同时干扰 Mxi1和 IRF3后CXCL10表达减少,凋亡细胞减少。 3.对两种遗传背景 Habu肾炎模型小鼠进行对比观察发现:C57BL/6小鼠表现出典型的系膜溶解病变,同时小鼠存活率明显优于FVB/N小鼠,凋亡检测结果显示C57BL/6模型小鼠肾组织内凋亡水平高于FVB/N小鼠,而FVB/N模型小鼠呈现不典型的系膜溶解表型;在增殖期C57BL/6模型小鼠系膜细胞增殖程度高于FVB/N模型小鼠,细胞增殖高峰均在模型建立的第7天,C57BL/6模型小鼠细胞增殖持续至模型建立的第14天;在免疫验证相关因子表达方面C57BL/6模型小鼠肾组织内CCL2和CXCL10表达水平高于FVB/N模型小鼠;生化指标检测结果提示两种小鼠均没有出现肾功能异常。 结论: 1. Mxi1-/-小鼠系膜增生性肾炎病理表型较野生型小鼠更典型更重,凋亡细胞比例较高,免疫炎症相关因子CXCL10表达升高,TLR4-IRF3通路被激活。 2. Mxi1失活诱导的CXCL10能够通过caspase3依赖的凋亡途径引起系膜细胞凋亡,TLR4-IRF3活化诱导了CXCL10的表达。 3.利用C57BL/6小鼠建立的系膜增生性肾炎模型的病理表型较FVB/N小鼠更典型更重,C57BL/6更适于建立小鼠Habu肾炎模型。