论文部分内容阅读
目的探索PIP5K1γ及其SUMO化修饰与角质形成细胞功能的关系。方法及内容第一部分:PIP5K1γ能够特异的发生SUMO化修饰:在HEK293T细胞中分别转染HA-PIP5K1α、HA-PIP5K1β、HA-PIP5K1γ质粒以及FLAG-UBC9,通过免疫共沉淀及蛋白免疫印迹检测发现何种类型的PIP5K可以与UBC9结合;在HEK293T细胞中过表达HA-PIP5K1γ、FLAG-SUMO1和Myc-UBC9,通过免疫共沉淀和蛋白免疫印迹方法检测PIP5K1γ的是否确实发生SUMO化修饰;在HEK293T细胞中过表达HA-PIP5K1γ、FLAG-SUMO1、RGS-HIS-SENP1和RGS-HIS-SENP1mutant,通过免疫共沉淀和蛋白免疫印迹法检测进一步确定PIP5K1γ的SUMO化修饰的作用。在大肠杆菌中过表达GST-PIP5K1γ和pE1E2S1,共培养后裂解细菌提取蛋白,通过免疫共沉淀和蛋白免疫印迹法检测PIP5K1γ的SUMO化修饰;同时,内源性PIP5K1γ的SUMO化修饰则在角质形成细胞HaCat中免疫沉淀内源性PIP5K1γ后经蛋白免疫印迹法和SUMO1抗体检测进行分析;在HEK293细胞中过表达HA-PIP5K1γ-WT、HA-PIP5K1γ-KD和FLAG-SUMO1,检测PIP5K1γ酶活性丧失对PIP5K1γ的SUMO化修饰的影响。第二部分:鉴定PIP5K1c的SUMO化修饰位点,并探索PIP5K1γ对细胞增殖和迁移的影响及作用机制:首先通过生物信息学预测PIP5K1c潜在的SUMO化修饰位点,结果发现251,408和591位氨基酸可能为潜在的SUMO位点。通过分子克隆技术,我们将赖氨酸突变成精氨酸;在HEK293T中共转染HA-PIP5K1γ野生型、K251R、K408R、K591R点突变和FLAG-SUMO1,通过蛋白免疫印迹法检测PIP5K1γ的SUMO表达量,验证SUMO修饰位点;在大肠杆菌中共转PIP5K1γ野生型、点突变型和pE1E2S1,进一步确认SOMO修饰位点;应用CRISPR/CAS9技术在HaCat中构建PIP5K1γ稳定敲除的细胞系,通过细胞划痕实验观察PIP5K1γ敲除之后对HaCat细胞迁移能力的影响;使用IncuCyte○RS3活细胞分析系统实时监测细胞活性,检测细胞增殖能力;通过蛋白免疫印迹法检测与肿瘤增殖与迁移相关的蛋白在PIP5K1γ敲除后的HaCat细胞系中表达变化。第三部分:为了明确苏木化修饰对PIP5K1γ参与的HaCat细胞中的功能影响,在PIP5K1γ缺失的HaCat的细胞株基础上重构了PIP5K1γ-WT和苏木化修饰缺陷的PIP5K1γ-mutant,通过细胞划痕实验和Transwell实验观察PIP5K1γ的苏木化修饰对细胞迁移功能的影响;同时使用IncuCyte○RS3活细胞分析系统检测细胞增殖能力;通过质膜分离试剂盒分离胞质、胞膜、核蛋白,检测苏木化修饰是否通过影响PIP5K1γ在细胞中的定位,从而影响了细胞功能;通过使用蛋白酶体抑制剂MG132观察苏木化修饰是否通过影响PIP5K1γ的蛋白稳定性而影响细胞功能;通过使用放线菌酮CHX观察SUMOylation是否通过影响蛋白半衰期来影响细胞功能;在HEK293T细胞中过表达HA-PIP5K1γ-WT、苏木化修饰缺失的HA-PIP5K1γ-K591R点突变型和HIS-Ubiquitin,观察SUMOylation是否影响了PIP5K1γ的泛素化降解;从PIP5K1γ-Null、PIP5K1γ-WT、PIP5K1γ-K591R细胞系中抽提合成脂质体PIP2,通过使用Elisa试剂盒检测PIP2的合成情况;通过蛋白印迹实验检测PIP5K1γ的苏木化修饰对相关蛋白表达的影响。结论1.PIP5K1γ能够在体内外发生SUMO化修饰;2.PIP5K1γ影响着角质细胞的增殖和迁移;3.PIP5K1γ的SUMO化修饰通过调节PIP2的合成影响着角质细胞的增殖和迁移。