CD66a对人B-急淋白血病细胞增殖和凋亡的影响及其异常表达机制的研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:didi_1157
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前言:  白细胞在不同分化阶段和活化过程中,出现或消失的细胞表面标记叫白细胞分化抗原,现以CD(cluster of differentiation)命名。研究发现,正常细胞和肿瘤细胞所表达的CD抗原不同,并且CD抗原与多种肿瘤的发生发展有着密切联系,其中与白血病的相关性尤其令人重视。多项报道表明CD66就是一种异常表达于急性B淋巴细胞白血病(B-急淋)的膜分化抗原。正常情况下CD66表达只局限于髓细胞,淋巴细胞不表达CD66,但多位研究者却在B-急淋病例中发现癌变的B淋巴细胞表面有CD66表达。CD66又分为CD66a-CD66e亚型,其中CD66a和CD66c是异常表达于B-急淋白血病细胞的主要亚型。  CD66a,又名CEACAM1,是CEACAM家族的跨膜粘附分子,属于免疫球蛋白超家族。CD66a作为CD66家族的主要亚型异常表达于B-急淋白血病细胞中虽然已广泛报道,但这种异常表达引起的功能效应及其表达机制却尚无报道。CD66a的一个重要特性是它在某些癌细胞中抑制肿瘤生长,但在另外一些癌中如甲状腺癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤等却促进肿瘤进行性生长,并与转移和预后不良高度相关。鉴于CD66a在癌细胞中的矛盾作用,它在B-急淋白血病细胞中的生物学功能及异常表达机制值得研究,因此本课题采用CD66a(+)的B-急淋白血病细胞系BALL-1分析CD66a对B-白血病细胞增殖和凋亡的影响。  另外,为了研究CD66a表达机制,通过生物信息学软件分析,CD66a可能受转录因子PU.1调控。PU.1是造血系统的中心调控因子,不仅调节血细胞的正常分化,对白血病的发生也具有重要意义,其异常表达能导致白血病发生,因此选定PU.1抗体通过染色体免疫共沉淀-测序法(ChIP-sequencing)来检测PU.1在CD66(+)的B-急淋白血病细胞系BALL-1及CD66(-)的正常B淋巴母细胞系HMy2.CIR中的靶基因差异表达谱,用以分析PU.1及其调控的共表达基因与 CD66a的潜在关系,从而了解CD66a在B-急淋白血病中的异常表达机制,为B-急淋白血病治疗新策略提供理论基础。  实验材料:  人急性B淋巴细胞白血病细胞株BALL-1和人B淋巴母细胞HMy2.CIR购于中国科学院细胞库。  FITC标记的抗-CD66 mAb、小鼠IgG抗体(BD公司);兔抗人PU.1多克隆抗体(Santa Cruz);小鼠β-actin单克隆抗体(Santa Cruz);兔抗人LFNG多克隆抗体(abcam);兔抗人Hes1多克隆抗体(abcam); HRP标记的羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗(武汉博士德公司);  DMEM培养基、胎牛血清、1%青链霉素(Hyclone);无血清培养基Opti-MEM(Invitrogen); Trizol试剂(Invitrogen);二甲基亚砜(DMSO)、 DAPT(Sigma)  RT-PCR试剂盒与SYBR Green QRT-PCR试剂盒(Takara);全蛋白提取试剂盒(南京凯基);ECL试剂盒(Thermol);细胞周期检测试剂盒(上海碧云天生物公司);FITC-annexinⅤ/PI细胞凋亡双染试剂盒(南京凯基生物公司);ChIP试剂盒(Millipore);  引物合成(Takara); siRNA设计及合成(苏州吉玛基因公司)  流式细胞仪(Becton Dickinson,USA); QRT-PCR扩增仪LightCycler(RocheDiagnostics,USA);电转杯(BIO-RAD,USA);电穿孔仪ECM830(BTX,San Diego,CA);荧光化学发光成像分析仪(MF-Chemi BIS)  研究方法:  1、干扰CD66a功能后检测细胞增殖及凋亡:在B-急淋细胞系BALL-1细胞中通过用抗体阻断和siRNA电转染技术两种方法干扰CD66a表达,应用细胞周期检测试剂盒及FITC-annexinⅤ/PI细胞凋亡双染试剂盒研究CD66a被抑制后对B白血病细胞增殖和凋亡的影响,同时应用QRT-PCR检测了CD66a表达下调与Fas/FasL的mRNA表达水平变化的相关性。  2、ChIP-sequencing:应用PU.1抗体分别对CD66a(+)的BALL-1细胞和CD66a(-)的HMy2.CIR细胞进行ChIP-sequencing,获取转录因子PU.1调控的共表达基因谱。  3、筛选差异表达基因:根据基因表达谱及Gene Ontology和NCBI数据库提供的基因功能信息,选定一组与肿瘤发生有直接或间接关系且启动区仅在BALL-1中与PU.1结合而在HMy2.CIR中不与PU.1结合的基因,应用real-time PCR检测这些选定基因在BALL-1和HMy2.CIR细胞中mRNA水平,筛选出差异表达基因。  4、ChIP-PCR验证ChIP-sequencing结果:根据基因谱提供的PU.1与基因结合的位点数据,分别用BALL-1和HMy2.CIR中以PU.1抗体免疫沉淀得到的DNA为模板,扩增上述差异基因与PU.1结合位点的区域,经聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果以验证ChIP-sequencing可靠性。  5、差异基因LFNG与Notch信号对CD66a表达影响的研究:通过siRNA沉默LFNG基因后,用QRT-PCR和Western-blot检测CD66a及Notch信号通路下游基因Hes1的表达,研究LFNG对Notch通路和CD66a表达的影响。另外,应用γ分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号后,检测Notch通路对CD66a表达的影响,同时检测CD66a被抑制后对Notch信号通路下游基因Hes1表达的影响。  结果:  1、CD66a对BALL-1细胞的影响:CD66a抗体阻断CD66a功能及siRNA有效沉默CD66a基因后,BALL-1细胞周期检测显示细胞增殖指数降低伴S期百分比数减少,凋亡检测显示细胞早期凋亡和晚期凋亡百分比均升高。另外,CD66a被干扰后伴随Fas和FasL mRNA表达水平相应升高。  2、根据ChIP-sequencing结果筛选差异基因:根据PU.1靶基因表达谱及QRT-PCR结果,筛选出10个差异表达基因,这些基因的启动区仅在BALL-1细胞中与PU.1结合,而在HMy2.CIR细胞中其启动区不与PU.1结合,且它们在BALL-1细胞中的mRNA水平与HMy2.CIR细胞相比升高123倍至6.2倍不等,其中mRNA表达差异最大的是LFNG基因,为123倍。  3、ChIP-sequencing结果的验证:ChIP-PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示筛选出的差异基因在BALL-1免疫沉淀的DNA样品中扩增均为阳性,而在HMy2.CIR免疫沉淀的DNA样品及相应的IgG样品中扩增均为阴性。  4、LFNG基因与Notch通路对CD66a表达的影响:siRNA有效沉默LFNG基因后,Hes1表达下降,Notch通路被抑制,且CD66a表达相应下降。DAPT抑制Notch通路后也证实了CD66a表达降低。另外,CD66a基因沉默后,Hes1表达无变化,即CD66a不影响Notch通路。  结论:  1、CD66a在B-急淋白血病细胞系BALL-1中的异常表达能促进细胞增殖并降低凋亡,其对凋亡的影响可能与Fas/FasL信号通路有关。  2、ChIP-sequencing结果可靠,受PU.1调控的CD66a共表达基因谱提供了与CD66a表达机制有潜在关系的10个基因:LFNG,FGL2,GAB2,GPR77, CD84,ILRA4, TMBIM1, GNG2, DMXL2, PI3K。  3、LFNG基因沉默与DAPT均能抑制BALL-1细胞中的Notch信号通路并下调CD66a表达,提示LFNG基因过度表达与Notch信号异常活化是导致CD66a异常表达的机制之一。
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