近年来，恶性肿瘤已经成为威胁人类生命健康的主要杀手，我国每年因恶性肿瘤而死亡的人数达到220万，占我国居民死亡原因的第一位。因此，恶性肿瘤的治疗已经成为亟待解决的世界性难题，具有极其重要的战略意义。现如今，临床常用的肿瘤治疗手段包括手术、化疗和放疗等，手术只能使一部分肿瘤患者受益，而化疗和放疗对正常组织器官毒副作用大，严重影响患者的生活质量。此外，长期使用化学药物治疗肿瘤，会产生多药耐药现象（Multidrug resistance，MDR），降低了化疗药物的治疗效果。而与传统治疗手段相比，基因治疗有望从根本上治疗疾病，已成为目前国际学术界研究的焦点，它被认为是医学和药学领域的一次革命，是当今生物医学发展中最重要的里程碑之一，同时也必将对传统制药业产生深远影响和冲击，有望成为未来在肿瘤临床治疗中的“新宠”。基因治疗主要有三个方面：基因药物、基因诊断和基因传输。随着人类基因组计划（human genome project, HGP）的成功实施，基因诊断和基因药物的制备不再是基因治疗的障碍；但如何安全、有效的将药物基因运载到靶细胞并起到治疗效果，成为获得基因治疗良好效果的瓶颈之一。常见的基因递送方式可以分为物理方法、化学方法和生物方法。化学方法和生物方法都是利用载体承载基因药物，载体的地位极其重要，也成了基因治疗发展中的关键性问题。生物学上根据来源将基因载体分为质粒载体和病毒载体；而化学研究人员习惯将质粒看做DNA的一种，而将载体分为病毒类载体（ViralVector）和非病毒类载体（Non-viral Vector）。目前在临床使用中应用最多的仍然是病毒类载体，部分转染效率可高达90%以上，但病毒类载体存在严重的免疫源性等自身难以克服的缺陷。相对而言，非病毒类载体由于其特有的优势而越来越受到关注。聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI)分子已经成为了非病毒类基因载体领域里发展最快、最具有研究价值和应用潜质的一类基因传输载体。对于转染效率而言，理想的PEI分子量范围约为11.9×103~70.0×103，其中重均分子量为25K的超支化PEI（PEI25K）转染效率最高，因而成为衡量非病毒基因载体各项性能的“黄金标准”。PEI独特的“质子海绵效应”有利于实现细胞内的内涵体逃逸。然而，PEI25K作为非病毒基因载体材料仍然有很多缺陷，如相对较低的基因转染效率、细胞毒性大、聚合物结构的不可降解性等。因此，对其进行结构改造就显得尤为必要。本论文立足于肿瘤基因治疗这一当前研究热点，设计了两类新型PEI衍生物材料，我们首先将不同数量的带有疏水基团的N-乙酰-亮氨酸，以EDC/NHS催化，使其与PEI25K的伯氨基进行偶联，来研究N-乙酰-亮氨酸引入的数量对PEI25K作为基因传递材料能力的影响。然后在前期工作基础上，进行了N-异丙基丙烯酰胺改性PEI25K基因载体的制备及性能研究，通过一系列的化学及细胞实验对衍生物的材料结构、细胞毒性、核酸结合能力、基因转染效率进行研究，并采用改性后的PEI衍生物（PEN）将外源的p53基因递送到p53基因缺失的前列腺癌PC-3细胞系与p53野生型细胞系Hela中进行对比研究。第一部分：N-乙酰-亮氨酸(N-Ac-Leu)改性PEI25k基因载体的构建与评价1.本章采用EDC/NHS催化反应合成了三种N-Ac-Leu修饰的PEI衍生物，分别为N-Ac-Leu-PEI (60:1)、 N-Ac-Leu-PEI (80:1)、N-Ac-Leu-PEI (100:1)并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对聚合物的结构进行表征。2.通过凝胶电泳可以表明，三种N-Ac-Leu-PEI聚合物均能很好的与pEGFP质粒结合，但结合能力低于未修饰的PEI25K。通过表面电位测定可以得知三种N-Ac-Leu-PEI的表面电位在+30mV，恰好可以说明N-Ac-Leu-PEI与质粒结合能力的降低。粒径测定结果表明N-Ac-Leu-PEI聚合物的粒径在180~220nm范围内。3. N-Ac-Leu-PEI基因载体材料的溶血实验证明载体材料溶血效应相对于PEI25K明显降低，具有很好的血液相容性；蛋白吸附实验中，N-Ac-Leu-PEI蛋白吸附值相对于PEI25K明显降低，且随时间的增加蛋白吸附值缓慢降低。由此证明N-Ac-Leu基团的引入可改善PEI的生物相容性，可望用于活体实验中。4. MTT实验结果表明，N-Ac-Leu-PEI在HeLa细胞中的细胞毒性较PEI25K有明显降低。5.三种N-Ac-Leu-PEI聚合物均能有效的介导基因转染，且转染能力高于PEI25K。N-Ac-Leu-PEI (100:1)在质量比为3.0的条件下转染效率最高。第二部分：PEI衍生物基因载体的设计制备以及性能研究1.首先在PEI骨架上偶联上N-异丙基丙烯酰胺，然后通过细化投料比，得到五种PEI衍生物（PEN）。使用凝胶阻滞实验和细胞毒性试验初步筛选出一种载体。之后通过核磁共振氢谱对所选材料的结构进行了表征。2.使用纳米粒度电位仪检测了载体、质粒以及载体质粒复合物的粒径大小以及表面电位。3.通过MTT实验检测了载体的细胞毒性，结果显示，修饰后的载体毒性低于PEI。4. DNase I酶降解实验发现，在载体质粒质量比不小于0.8时，载体就能够实现对DNA的完全保护。相比较而言， PEN对DNA的保护能力较PEI略有下降。5.通过绿色荧光蛋白质粒转染实验和PGL-3质粒转染实验，分别定性定量考察了材料作为基因载体的传递性能。实验数据表明，在PEI上引入N-异丙基丙烯酰胺，降低了聚合物的表面电荷，并引入了一定量的疏水基团。但是疏水基团的过多引入反而会降低载体的基因转染效率。在定性转染试验中，改变载体的加入量发现，在载体质粒质量比为2时，转染效果最好。在定量转染实验中，PEI展现了不错的转染效率，PEN虽然不及PEI，但和商业转染试剂相比，转染效率相差无几。6.在前列腺癌细胞系PC-3中，通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平证明p53基因的表达。之后通过检测相关蛋白表达的变化证明表达出的p53蛋白的确具有正常的功能。之后通过检测caspase家族蛋白活性和线粒体膜电位变化辅助说明上述问题。7.使用流式细胞仪检测周期阻滞和细胞凋亡情况，在检测周期阻滞时发现Hela细胞系不存在周期阻滞现象，通过DAPI染色，证明细胞存在凋亡现象。8.综合各方面的实验结果，证明经过修饰，虽然在一定程度上降低了PEI的基因转染效率，但所得到的衍生物的毒性低，而且其基因转染效率可以和商业转染试剂相媲美。而且在递送p53基因致使癌症细胞凋亡的试验中，展现了较好的转染性能，后续的凋亡相关实验也证明外源的p53基因的确可以代替或者补偿内源性缺失或者无效的p53基因。