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·第一章:RAP@PFN1-CD-MNPs纳米载药体系的制备目的:本章围绕实现动脉粥样硬化诊疗一体化为目标,成功构建多功能纳米载药体系RAP@PFN1-CD-MNPs。在细胞、蛋白水平上进行一系列生物活性研究,探讨RAP@PFN1-CD-MNPs纳米体系的生物相容性及体外药物释放。材料与方法:①以环糊精为载体,装载雷帕霉素(RAP)以及超小超顺磁性氧化铁(USPIO),并通过共轭profilin-1抗体修饰,制备出RAP@PFN1-CD-MNPs多功能型纳米载药体系。②应用透射电子显微镜、Nano-ZS型纳米粒度仪、傅里叶变换红外光谱仪以及紫外吸收光谱等观察分析其表征、形貌、粒度、Zeta电位及结构等。③通过药物释放分析载药量、包封率及不同环境下纳米药物的控释。④利用红细胞溶血实验评价其血液相容性;细胞吸收实验及CCK法等方法分析RAP@PFN1-CD-MNPs对鼠主动脉血管平滑肌细胞(MOVAs)的体外靶向效果和生物相容性。⑤Western blotting检测分析profilin-1的表达。结果:①纳米颗粒在干燥状态下呈均匀的尺寸分布和单分散球形形态,平均粒径为15-30 nm,颗粒带有18.37 mV的正zeta电位;②饱和磁化强度(Ms)为69.85 emu/g,呈顺磁性;③RAP@PFN1-CD-MNPs纳米颗粒中的RAP载药含量(Drug loading content,LC)可达87%,RAP@PFN1-CD-MNPs的水解与缓冲溶液的pH有关,pH值越低,在相同的时间点,纳米粒子水解速度越快;④与不同浓度PFN1-CD-MNPs共同孵育后,小鼠红细胞(MRBCs)未发现明显的溶血现象;⑤纳米载体与MOVAS共培养1天、3天和7天,随着培养时间的延长,细胞毒性略有增加,在培养三天后,细胞存活率仍在80%以上;⑥MOVAS的体外荧光成像及普鲁士蓝结果显示PFN1-CD-MNPs与MOVAS的细胞结合度较高。结论:本研究成功构建的PFN1-CD-MNPs多功能纳米体系,可以作为优良的MRI T2阴性对比剂;PFN1-CD-MNPs纳米载药体系具有良好的稳定性,血液相容性、生物相容性及酸性环境响应能力;结合profilin-1抗体的纳米体系在体外对MOVAS具有良好的靶向效果。第二章:PFN1-CD-MNPs-Cy5.5纳米体系体内外双模态成像研究目的:通过体内MR成像及近红外荧光成像研究PFN1-CD-MNPs-Cy5.5纳米体系在体内的分布及靶向动脉粥样硬化斑块的成像效果。材料与方法:①通过体外MR成像测量不同浓度纳米粒子的弛豫时间及成像效果;②利用近红外荧光成像(NIRF)探测PFN1-CD-MNPs在体内各组织器官的分布;③载脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠通过高脂饮食构建动脉粥样硬化模型并测定其血清血脂谱改变;④Western blot分析动脉粥样硬化斑块的profilin-1表达;⑤利用7.0T小动物磁共振成像系统进行体内颈动脉粥样硬化斑块的MR成像;⑥利用近红外荧光成像进行离体主动脉斑块成像;⑦普鲁士蓝病理学分析验证纳米粒子的组织分布结果:①计算纳米粒子的横向弛豫率(r2)为90.3 mM-1 s-1,符合MRI阴性对比剂要求;②PFN1-CD-MNPs在血液中的循环时间相对较长,注射72h后,铁在肝脏和脾脏中沉积相对较多;③高脂饮食四个月成功构建ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型,油红O(ORO)大体染色及H&E染色均证实动脉粥样硬化斑块的存在;④与正常对照组相比,ApoE-/-组HDL-C、LDL-C和TC水平显著升高,高脂饮食7个月时血清TC和脂蛋白水平高于4个月时;⑤与C57BL/6正常组相比,ApoE-/-组动脉壁上的profilin-1蛋白表达明显增高;⑥与注射前相比,注射PFN1-CD-MNPs 24h后的ApoE-/-小鼠颈动脉MR成像提示明显的T2加权信号衰减,而CD-MNPs组中颈动脉壁几乎没有信号变化,具有统计学意义;⑦与CD-MNPs-Cy5.5注射组相比,PFN1-CD-MNPs-Cy5.5注射组主动脉的荧光信号明显增高,具有统计学意义。结论:PFN1-CD-MNPs被网状内皮系统摄取相对增多;高脂饮食4个月可成功构建动脉粥样硬化模型,随着高脂饮食的时间延长,血脂水平逐渐升高;通过MRI及NIRF可实现体内外动脉斑块成像;profilin-1蛋白在动脉硬化斑块区高表达,与PFN1抗体分子偶联的纳米颗粒对动脉粥样硬化斑块具有更精准的靶向效果。第三章:RAP@PFN1-CD-MNPs纳米体系体内抗动脉粥样硬化疗效研究目的:通过离体主动脉荧光成像、血液生化指标以及免疫组织化学等方法,进一步深入评估RAP@PFN1-CD-MNPs多功能纳米载药体系的安全性以及动脉粥样硬化的干预效果。材料与方法:①通过高脂喂食8周后随机分3组并分别给与靶向纳米药物、非靶向纳米药物及生理盐水不同干预,同时继续高脂喂食至16周;②通过离体荧光成像、油红染色观察不同组间的主动脉斑块病变范围;③对不同组的ApoE-/-小鼠主动脉进行Masson三色染色及免疫组织化学分析,通过分析斑块胶原相对含量、CD68相对含量及α-SMA的相对含量,进一步评估药物治疗后斑块的稳定性;④通过观察主要脏器的H&E染色及血液生化指标,评估RAP@PFN1-CD-MNPs纳米体系的体内潜在毒性。结果:①主动脉离体荧光成像显示RAP@PFN1-CD-MNPs干预组荧光信号最弱,生理盐水对照组信号最强;②ORO主动脉染色的体式显微成像中观察到生理盐水对照组中主动脉斑块面积最广泛;③用RAP@PFN1-CD-MNPs干预后,ORO染色显示主动脉斑块面积减少,以主动脉弓横断面的减少更为显著,差异具有统计学意义;④Masson三色染色显示载药纳米体系干预后,斑块周围胶原相对含量增加,且RAP@PFN1-CD-MNPs组显著增加;⑤根据免疫组织化学染色结果,在雷帕霉素纳米体系组中CD68的相对含量减低和α-SMA相对含量增加;⑥H&E显示ApoE-/-小鼠的非靶器官没有明显器质性损伤,而RAP@CD-MNPs组的肾功能指标(肌酐(CREA)、尿酸(UA))和心功能指标(肌酸激酶(CK))显著高于对照组和RAP@PFN1-CD-MNPs组;⑦血脂指标(CHOL、HDL、LDL-C和TG)在对照组和纳米药物组(RAP@CD-MNPs和RAP@PFN1-CD-MNPs组)之间无显著差异。结论:通过腹腔内给予RAP@PFN1-CD-MNPs的干预明显延缓了斑块的发展,病变面积明显减少;与RAP@-CD-MNPs相比,RAP@PFN1-CD-MNPs可以更有效地缓解动脉粥样硬化的发展;雷帕霉素通过减少巨噬细胞以及增加斑块中的SMCs来发挥其稳定斑块的作用;在长期治疗中,RAP@PFN1-CD-MNPs纳米系统未发现明确的心肾功能损伤;雷帕霉素在不改变血清脂质水平的情况下有效地减轻炎症、抑制斑块进展和增强动脉粥样硬化斑块的稳定性;本研究合成的RAP@PFN1-CD-MNPs纳米系统没有表现出明显的副作用,因此它是一种用于干预动脉粥样硬化疾病相对安全的多功能纳米系统。