流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)简称乙脑,乙脑是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一种严重的病毒性脑炎疾病,该病毒属于黄病毒科,通过库蚊在动物和人宿主之间传播。日本脑炎普遍流行于整个亚洲东部、南部和环太平洋地区。大多数的乙脑患者为儿童,约半数幸存者有认知或是运动障碍后遗症。目前应用的乙型脑炎疫苗有鼠脑纯化灭活疫苗和减毒活疫苗,后者是中国的SA14-14-2病毒株,为地鼠肾细胞减毒活疫苗,源自SA14野生型,另外,嵌合重组体减毒疫苗正在研究中。由于目前尚缺乏特异性抗病毒药物,只是采用对症治疗和支持治疗,对乙型脑炎的早期诊断显得极为重要。实验室诊断一般采用ELISA方法检测IgM,另外还有琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等方法,但是这些方法都存在灵敏度低且经验依赖性强等特点；分子生物学方法虽使灵敏度提高了,但是每次检测只能针对一种基因型进行检测,不能满足实际临床检测的需要。本研究根据乙型脑炎病毒的PrM和E基因序列的差异性,构建了乙型脑炎病毒分型基因芯片,用于乙型脑炎病毒的分型,具有检测乙型脑炎病毒和同步鉴别乙型脑炎病毒Ⅰ型和Ⅲ型的功能。本研究共分为以下3部分：1探针和引物设计部分本研究部分主要包括阳性标准质粒的制备、芯片探针和引物的设计。应用RT-PCR分别扩增各基因型的特异片断,并克隆到载体上,构建重组质粒。将重组质粒测序后,应用DNAStar软件将测序结果与相应病毒基因型核酸序列进行同源比对,结果证明与其相应的基因型的大部分毒株的同源性在94%以上。根据Genbank发表的核酸序列,运用BLAST软件,分析序列间的差异性,分别设计特异分型引物和诊断探针。2芯片杂交条件的优化本研究主要包括芯片的制备、探针浓度的选择,杂交时间和杂交温度的优化。将探针稀释为30μM,点加到玻片上,37℃固定12h以上,制备基因芯片,对杂交条件的优化进行测定。结果筛选出较佳探针浓度为40μM,杂交温度为42℃,杂交时间3h。3不对称PCR在芯片中的应用本研究主要包括对优化后的芯片灵敏度、特异性、重复性检测及不对称PCR技术提高芯片杂交效率。本试验选择了1：25、1：50、1：100和1：200的不同引物浓度比例,进行不对称PCR。结果显示,制备的芯片具有良好的特异性和可重复性,灵敏度比PCR高；芯在引物浓度为1：50时杂交结果最好,与对称PCR的芯片检测结果相比,杂交信号明显增强。