论文部分内容阅读
目的：1、采用密度梯度离心联合差壁培养法，建立一种较理想的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs）体外培养扩增体系。2、在体外研究探讨利拉鲁肽（Liraglutide，LIRA）对BM-MSCs定向诱导分化的作用，并比较其与胰升糖素样肽1（Glucagon-like Peptide-1，GLP-1）的诱导效果差异。3、观察利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞（LIRA+BM-MSCs）移植对链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（Type1Diabetes Mellitus，T1DM）大鼠胃肠道激素水平和胰岛β及α细胞功能的影响。方法：1、依据骨髓细胞比重的差异性，利用大鼠淋巴细胞分离液初步分离骨髓单个核细胞，再根据其差壁生长特性，通过定期换液的方式对其中单个核细胞进一步纯化，最后以流式细胞仪测定分离后P3代细胞间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD73和CD105，造血干细胞表面标志CD34以及白细胞表面标志CD45，并在特定培养基下观察其向成骨以及成脂细胞分化的能力。2、在高糖、低糖加尼克酰胺的两阶段诱导基础上，以GLP-1为对照，荧光定量PCR检测巢蛋白（Nestin）、胰十二指肠同源盒1（PDX-1）、葡萄糖激酶（GK）、葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）、胰岛素（Ins）和胰高血糖素（GLu）等基因的水平，细胞免疫荧光测定胞浆Ins和GLu蛋白的表达，观察10nmol/L利拉鲁肽继续诱导7天对BM-MSCs向胰岛样细胞分化的作用。3、以60mg/kg剂量腹腔注射STZ制备T1DM大鼠模型，造模成功后随机分为1型糖尿病模型对照组（T1DM组，n=10）、骨髓间充质干细胞治疗组（T1DM+BM-MSCs组，n=10）、利拉鲁肽治疗组（T1DM+LIRA组，n=10）、利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞治疗组（T1DM+LIRA+BM-MSCs组，n=10）四组。定期监测各组大鼠随机血糖水平以及一般情况变化；8周末，测定各组大鼠糖化血红蛋白（HbA1c）、24h尿量以及24h尿蛋白水平；采用ELISA法检测血清胰岛素、C肽、胰高血糖素、胃泌素、胆囊收缩素和胰升糖素样肽1等胃肠道激素的浓度；免疫组织化学染色检查胰腺组织胰岛素和胰高血糖素的表达。结果：1、显微镜下见分离的BM-MSCs形态均一、呈长梭形；流式细胞仪检测提示：分离的BM-MSCs高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD73和CD105，而不表达造血干细胞表面标志CD34和白细胞表面标志CD45；BM-MSCs成骨及成脂诱导分化能力检测阳性。2、添加利拉鲁肽或GLP-1诱导后BM-MSCs进一步呈聚集性生长，DTZ染色阳性；荧光定量PCR检测提示：与高糖加尼克酰胺诱导组比较，利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组Nestin的mRNA含量明显减少（P<0.01），PDX-1、GK、GLUT-2、Ins以及GLu的含量均升高（P<0.05），利拉鲁肽诱导组与GLP-1诱导组比较，各基因含量均无明显差异（P＞0.05）；细胞免疫荧光检测提示：未诱导组和高糖加尼克酰胺诱导组BM-MSCs胞浆Ins或Glu蛋白表达阴性，利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组BM-MSCs胞浆Ins和Glu蛋白均表达阳性。3、一般指标：与T1DM组比较，T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组大鼠随机血糖、HbA1c、24h尿量以及24h尿蛋白量均明显降低（P＜0.01），其中各指标水平均以T1DM+LIRA+BM-MSCs组最低（P＜0.05）。胃肠道激素：与T1DM组比较，T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组血清胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平均明显升高(P＜0.05)；T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰升糖素样肽1的水平明显升高（P＜0.05），胰高血糖素的水平明显降低(P＜0.05)，T1DM+BM-MSCs组胰升糖素样肽1和胰高血糖素的水平与T1DM组比较无差异（P＞0.05）。与T1DM+BM-MSCs组比较，T1DM+LIRA组胰升糖素样肽1的水平升高（P＜0.05），胰高血糖素的水平降低（P＜0.05），胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平无明显差异（P＞0.05）；T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰高血糖素的水平降低（P＜0.05），胰岛素、C肽、胃泌素、胆囊收缩素以及胰升糖素样肽1的水平均明显升高（P＜0.05）。与T1DM+LIRA组比较，T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平均明显升高（P＜0.05），而胰升糖素样肽1和胰高血糖素的水平均无差异（P＞0.05）。相关性分析：8周末各组大鼠血清胰岛素水平与胃泌素（r=0.544，P＜0.01）、胆囊收缩素（r=0.710，P＜0.01）和胰升糖素样肽1（r=0.669，P＜0.01）的水平呈正相关,与胰高血糖素的水平呈负相关（r=-0.506，P＜0.01）；血清胰高血糖素水平与胃泌素（r=-0.364，P＜0.05）、胆囊收缩素（r=-0.433，P＜0.01）和胰升糖素样肽1（r=-0.591，P＜0.01）的水平呈负相关。胰腺免疫组化：与T1DM组比较， T1DM+BM-MSCs、 T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组胰岛素阳性占胰岛细胞面积比例均明显升高（P＜0.01），其中以T1DM+LIRA+BM-MSCs组的阳性面积比例最高（P＜0.01），T1DM+BM-MSCs组与T1DM+LIRA组比较，两组无明显差异（P＞0.05）；与T1DM组比较，T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰腺组织胰高血糖素阳性占胰岛细胞面积比例均明显降低（P＜0.01），T1DM+BM-MSCs组无明显差异（P＞0.05）；与T1DM+BM-MSCs组比较，T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰腺组织胰高血糖素阳性面积比例均明显降低（P＜0.01）；与T1DM+LIRA组比较，T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰腺组织胰高血糖素阳性占胰岛细胞面积比例降低（P＜0.05）。结论：1、通过密度梯度离心联合差壁培养法可以一次性获得大量的BM-MSCs。2、利拉鲁肽可以进一步促进BM-MSCs分化为胰岛样细胞，且诱导效果与GLP-1相当。3、利拉鲁肽联合BM-MSCs移植治疗可通过提高T1DM大鼠机体的多种胃肠道激素水平和对胰岛β及α细胞功能进行双向调控，从而比两者单独治疗能够更好地改善大鼠糖代谢。