最新癌症数据统计显示在发达国家,前列腺癌仍然是男性癌症死亡的主要原因之一。而且,近年来在我国前列腺癌的患病率和死亡率也呈现上升趋势。然而,前列腺癌的基本机制仍然在很大程度上是未知的。因此,阐明前列腺癌进展的生物学机制是非常重要的。miR-29a-3p作为一种小的非编码RNA,参与细胞增殖,凋亡,分化等生理生化过程。miR-29a-3p在肿瘤的发展中也起到重要作用。最近,有研究显示,miR-29a-3p在前列腺癌组织中是异常表达的并且与细胞的侵袭、增殖等相关,但其在协调氧化应激,凋亡和增殖中的作用机制至今尚未报道。血红素加氧酶-1(HO-1)是一种细胞保护酶,具有抗氧化应激的作用。此外,其在抗炎和抗凋亡中也起关键作用。并且研究表明内源性HO-1通常在肿瘤组织中要比其在周围正常组织中表达要高。然而在前列腺癌中,HO-1和microRNA之间的作用关系尚没有研究。Bach2为CNC家族中B细胞特异性转录因子,有研究显示Bach2可通过抑制HO-1诱导细胞凋亡来应对氧化应激。并且Bach2在血液系统恶性肿瘤中发挥着重要作用,然而关于Bach2在实体瘤中的机制的报道却很少。目前在前列腺癌中关于Bach2调控氧化应激的作用尚未报道。因此在本研究中,我们旨在探讨miR-29a-3p/Bach2/HO-1在前列腺癌中作用及其分子机制。目的:探索miR-29a-3p对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其在前列腺癌进展中的作用。方法:1对在临床收取的20组人类前列腺癌组织和前列腺增生组织,HO-1联合miR-29a-3p荧光探针原位杂交定位miR-29a-3p的表达。2实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-29a-3p、Bach2在前列腺癌和前列腺增生组织中的表达。3免疫组织化学染色观察前列腺增生和前列腺癌组织中ho-1的表达量。4通过miranda和rnahybrid两网站对细胞凋亡和增殖相关基因进行预测。5合成靶基因3’非编码序列(utr)及其突变体并连接到pmir-glo双荧光报告质粒中,转染pc3细胞并进行双荧光报告基因活性检测。6pc3细胞中过表达或敲低mir-29a-3p,westernblot检测ho-1、bach2、pcna、caspase3和cyclind1的表达。7对pc3细胞进行敲低mir-29a-3p同时给予doc刺激,进行ho-1和bach2免疫双荧光染色。8在pc3细胞中过表达或敲低ho-1的同时给予doc刺激,tunel法检测细胞凋亡情况。9在pc3细胞中敲低mir-29a-3p的同时给予doc刺激,染色质免疫共沉淀技术(chip)检测bach2与ho-1启动子之间的关系。结果:1mir-29a-3p在临床前列腺癌组织和前列腺癌细胞系中是上调的荧光定量pcr结果显示,与bph组织相比,mir-29a-3p在前列腺癌组织中的表达显著增加(p<0.01)。mir-29a-3p荧光探针免疫染色的原位杂交结果显示,mir-29a-3p在前列腺癌组织中显著表达,而在bph组织中表达很少。此外,荧光定量pcr结果显示,与正常前列腺上皮细胞相比,mir-29a-3p在所有lncap、pc3、du-145三种前列腺癌细胞系中的表达均显著上调。以上结果表明,mir-29a-3p在前列腺癌组织中的表达上调。2体外实验中mir-29a-3p促进前列腺癌细胞的迁移和增殖体外培养的pc3细胞分别过表达和敲低mir-29a-3p。细胞划痕实验结果显示,与对照组相比,过表达mir-29a-3p促进细胞的迁移。相反,敲低mir-29a-3p后,抑制细胞的迁移。同时,westernblot实验结果显示,过表达mir-29a-3p后,pcna、cyclind1的蛋白表达量增高,而caspase3的蛋白表达量降低。敲低mir-29a-3p后,pcna、cyclind1的蛋白表达量明显降低,caspase3的蛋白表达量显著升高。同时,在lncap细胞中,过表达和敲低mir-29a-3p,westernblot显示类似的结果。以上结果表明,在体外,mir-29a-3p能够促进前列腺癌细胞的迁移和增殖。3mir-29a-3p通过增加ho-1的表达来促进前列腺癌细胞的生长免疫组织化学染色结果显示,在前列腺癌不同阶段样本中,临床分期,psa水平以及gleason等级越高,ho-1的表达量也越高。转染pc3细胞24小时后,westernblot结果显示,较mimicctl组,mimicmir-29a-3p组ho-1蛋白的表达水平是升高的。而较mimicmir-29a-3p+anti-ctl组,mimicmir-29a-3p+anti-mir-29a-3p组ho-1蛋白表达水平则被抑制。mir-29a-3p荧光探针结合ho-1免疫染色的原位杂交结果显示,mir-29a-3p和ho-1在前列腺癌组织中的表达要比在bph组织中的表达明显增高。不同浓度doc处理pc3细胞24小时后,qrt-pcr结果显示,mir-29a-3p的表达呈多西紫杉醇浓度依赖性降低。转染pc3细胞,过表达和敲低mir-29a-3p,同时给予doc刺激,westernblot结果显示,较对照组,doc刺激组的ho-1蛋白表达水平降低,caspase3蛋白水平升高。较其他组,anti-mir-29a-3p+doc(10nm)组ho-1蛋白表达水平显著降低,而caspase3蛋白水平显著升高。过表达和敲低ho-1,并给与doc处理细胞,流式细胞术结果显示,较其他组,doc+ho-1敲低组显著增加细胞凋亡。tunel荧光染色分析结果显示类似的结果。以上结果显示mir-29a-3p增加ho-1的表达从而促进前列腺癌细胞的生长。4在前列腺癌中bach2是mir-29a-3p的直接靶标选取的mir-29a-3p的潜在靶基因进行荧光报告基因检测,结果显示,与对照组相比,含有wtbach23’utr的细胞可被mir-29a-3p模拟物抑制。westernblot实验显示,与对照组相比,mir-29a-3p过表达组bach2的蛋白水平显著降低,而敲低组bach2蛋白表达水平显著升高。qrt-pcr结果显示,与临床bph组织相比,前列腺癌组织中bach2的表达水平较低。随后进行bach2和mir-29a-3p表达的相关性分析,结果显示,bach2和mir-29a-3p在mrna水平上具有显著的统计学负相关性。5补救实验确认mir-29a-3p/bach2/ho-1轴调控前列腺癌发展补救实验,westernblot结果显示,在doc处理的条件下,与对照组相比,mir-29a-3p过表达可增加ho-1蛋白的表达,降低bach2蛋白的表达。相反,mir-29a-3p敲低可降低ho-1蛋白的表达,增加bach2蛋白的表达。当共转染ad-mir-29a-3p和si-bach2时,结果显示,与其他组相比,Ad-miR-29a-3p+si-Bach2组Bach2蛋白水平显著降低,而HO-1蛋白水平显著升高。6 Bach2通过结合HO-1启动子来调节HO-1的表达HO-1和Bach2免疫双荧光染色结果示,与对照组相比,miR-29a-3p敲低组的HO-1表达水平降低,Bach2的表达水平升高。当给予DOC刺激后,与对照组相比,miR-29a-3p敲低组的HO-1表达水平显著降低,Bach2的表达水平显著升高。荧光报告基因检测示,与对照组相比,敲低Bach2显著增加HO-1启动子活性。染色质免疫共沉淀(CHIP)实验结果显示,miR-29a-3p敲低组增加了Bach2与HO-1启动子的结合。以上结果表明Bach2可通过结合HO-1启动子来调控HO-1的表达。7在体内miR-29a-3p可促进前列腺癌的发生发展裸鼠皮下接种稳定转染的PC3细胞荷瘤。定期观察发现,稳定转染了LV-Anti-miR-29a-3p的PC3细胞的异种移植瘤组的肿瘤体积明显比对照组的小。上述所有结果表明mi R-29a-3p在前列腺癌进展中起到重要作用。结论:1 miR-29a-3p在前列腺癌组织和前列腺癌细胞中是高表达的。2 miR-29a-3p在体外和体内均可促进前列腺癌细胞的增殖。3 miR-29a-3p通过增加HO-1的表达,从而起到抗凋亡,促增殖作用。4在前列腺癌细胞中Bach2是mi R-29a-3p的直接靶基因。5 miR-29a-3p通过靶向抑制Bach2促进与氧化应激相关基因HO-1的表达,进而导致前列腺癌细胞的发展。