基于核酸适配体的赭曲霉毒素A SPR检测技术研究

来源 :北京化工大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:zjfjh2008
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赭曲霉毒素A(OTA)是一种氯酚类真菌毒素,广泛存在于植物来源的食物中,严重危害消费者健康。我国现行限量标准规定谷物、豆类及其制品中OTA限量为5 ng-mL-1。鉴于食品中OTA污染的普遍性和危害性,建立食品基质中可靠、快速的OTA检测方法对食品安全管理具有重要的现实意义。表面等离子体共振(SPR)生物传感技术具有非标记、实时、灵敏和快速等特性,并已广泛应用到生物化学分析中。核酸适配体作为一种新型识别分子,相比于抗体具有获得简单、性质稳定、价格便宜、容易修饰等优势。本文将SPR技术与核酸适配体技术相结合,建立了一种新型的OTA检测方法。通过采用简便的萃取处理方法,实现了红酒和花生油中OTA的检测。1、通过文献调研,本课题选择的OTA核酸适配体序列为:OTA-aptamer (5’to 31):ATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGC ATCGGACA。2、利用等温滴定量热法测定溶液状态下OTA-aptamer与OTA的结合特性。通过条件优化,确定OTA-aptamer与OTA的浓度分别为8 μM、99μM;等温滴定量热法数据采用" one set of sites "模型拟合,KA=8.83×106±1.20×106 M-1、N=1.34±0.01,与文献结果相当;并且验证了二价金属离子对OTA-aptamer结合活性的影响。3、链霉亲和素通过氨基偶联方式固定在SPR的CM5芯片上,用于捕获生物素化的适配体;优化样品分析进样时间、解离时间和再生条件等实验因素;并验证该方法的特异性,选择与OTA分子量相近的四中小分子(赭曲霉毒素B (OTB)、N-乙酰-L-苯丙氨酸(Ac-Phe-OH)、卡那霉素A (KanA)和黄曲霉素B1 (Afbl)进行实验,结果显示方法特异性好:该方法分析OTA标准品获得工作曲线(n=3),OTA浓度在0.095~100 ng·mL-1范围内与相应信号呈四因素关系,在0.095~10 ng·mL-1范围内与响应信号呈线性相关关系,本方法的最低检测限为0.005 ng·mL-1。4、将上述方法进一步应用到实际样品中的OTA检测,选择红酒和花生油两种样品进行研究;通过优化条件,建立了两种简单高效的OTA液-液萃取方法。用商品化ELISA试剂盒作为比较方法,结果发现低浓度回收率偏高,原因可能是实际样品对ELISA检测有较强基质干扰。采用SPR方法,当食品样品中OTA浓度分别为3、40、75 ng·mL-1,平均回收率为86.92-116.54%。
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