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研究目的阐述lncRNA GAS5在肝癌组织及细胞中的表达水平和对肝癌细胞侵袭转移的影响及其分子调控机制,为今后肝癌的发生发展、诊断、靶向治疗及预后提供新的途径和研究思路。研究方法(1)利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测肝癌组织及癌旁组织中lncRNA GAS5及miRNA-21的表达水平和肝癌细胞中miRNA-21的表达;普通逆转录PCR(RT-PCR)检测肝癌细胞中lncRNA GAS5的表达。(2)依据人群中lncRNA GAS5及miRNA-21表达水平,利用Kaplan-Meier分析方法研究lncRNA GAS5及miRNA-21对肝癌患者生存率的影响。(3)分别在Bel-7402、HCCLM3细胞中转染GAS5-siRNA、pCDNA-GAS5,检测肝癌细胞中miRNA-21的表达;利用软件RNA22 program分析lncRNA GAS5与miRNA-21的结合位点;荧光素酶基因报告实验验证这一结合位点。(4)分别对Bel-7402、HCCLM3细胞行共转染实验,利用Western blots检测miR-21靶基因PDCD4、PTEN的表达。(5)Bel-7402、HCCLM3细胞中敲除及高表达GAS5后,运用Transwell实验检测肝癌细胞侵袭转移的情况;在Bel-7402及HCCLM3细胞中分别共转染后,运用Transwell及划痕实验检测GAS5对肝癌细胞侵袭转移的进一步影响。研究结果(1)通过qRT-PCR及RT-PCR发现,lncRNA GAS5在肝癌组织及肝癌细胞系中表达较低,miRNA-21的表达则较高,且它们的表达与肝癌的肿瘤大小、TNM分期及肝癌细胞系恶性程度相关。(2)人群中高表达lncRNA GAS5及低表达miRNA-21的患者有较高生存率。(3)在Bel-7402、HCCLM3细胞中分别敲除lncRNA GAS5及高表达lncRNA GAS5后,我们发现miRNA-21表达升高及降低;RNA22 program 得出 lncRNA GAS5 与 miRNA-21 的结合位点在 lncRNA GAS5第4外显子,且荧光素酶报告基因实验发现在肝癌细胞中lncRNA GAS5直接调控miRNA-21的表达。(4)在Bel-7402细胞中转染GAS5-siRNA后PDCD4、PTEN蛋白表达降低,转染了 pCDNA-GAS5的HCCLM3细胞结果则相反;在Bel-7402细胞中共转染GAS5-siRNA及anti-miR-21后,miR-21表达降低逆转了lncRNA GAS5下调所致的PDCD4、PTEN蛋白的表达降低,在共转染了pCDNA-GAS5 和 miR-21-mimic 的 HCCLM3 细胞中结果相反;(5)在 Bel-7402、HCCLM3细胞中分别敲除及高表达GAS5后,肝癌细胞的侵袭转移能力分别升高及降低;对Bel-7402细胞共转染GAS5-siRNA及anti-miR-21后进行Transwell及划痕实验,miR-21表达降低逆转了 lncRNA GAS5下调促进Bel-7402细胞侵袭转移的作用,在共转染了 pCDNA-GAS5和miR-21-mimic的HCCLM3细胞中结果相反。研究结论本项研究阐明了 lncRNA GAS5作为抑癌基因可预测肝癌患者预后,并且通过调控miRNA-21及其靶基因可抑制肝癌细胞的侵袭转移,lncRNA GAS5这一作用可为肝癌今后的发生发展提供一种新的诊断及靶向治疗方法。