半胱氨酸蛋白酶抑制剂,也称为胱抑素,在各种生物中广泛存在着,其能够抑制活性中心中含有半胱氨酸(cySH)残基的半胱氨酸蛋白酶。与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C相比,半胱氨酸蛋白酶抑制剂F抑制半胱氨酸蛋白酶的机制很少报道。在本研究中,首先构建重组质粒pPIC9K-CST7,之后将其导入进巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中。经甲醇诱导表达及组氨酸标签纯化最终获得一种具有活性的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂F。测量重组胱抑素F的抑制活性,并计算IC50为4.78μM。利用Lineweaver-Burk双倒数分析法对抑制类型进行分析,发现在添加不同重组胱抑素F浓度的蛋白酶水解反应中,未观察到Vmax的明显变化,而Km值随抑制剂浓度的增加而增加,胱抑素F的抑制类型为与蛋白酶底物的竞争性抑制。等温滴定量热分析显示出其与木瓜蛋白酶的结合能力(Kd=9.387×10-7M),根据化学计量比显示重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂F与木瓜蛋白酶相结合的比例为1:1。在胱抑素F和木瓜蛋白酶的结合过程中,β-折叠的二级结构显著增加,无规则卷曲的百分比减少,荧光强度在逐渐降低。结合木瓜蛋白酶晶体结构(PDB ID:3LFY)中活性位点Cys25、Asp158、His159紧邻的二级结构及具有荧光发光能力的氨基酸残基Tyr64、Trp177,半胱氨酸蛋白酶抑制剂F与蛋白质底物竞争性地结合木瓜蛋白酶活性位点,导致显著的抑制活性。为了进一步验证表达纯化出的重组胱抑素F对提升鱼糜凝胶强度的实际效果,将重组胱抑素F添加到鱼糜凝胶中。实验结果表明,重组胱抑素F能够显著提高鱼糜凝胶强度、质构特性及持水力等指标,而对鱼糜的白度不发生显著性影响。当重组胱抑素的添加量在2.5‰-10‰之间时,随着添加量的增加,品质逐步提高,其中凝胶强度提升了32%,回复性从0.369提升至0.416提高了12.7%,持水能力从63%升高到67%整体提高了6.3%。当重组胱抑素F添加量高于10‰时,胱抑素F对半胱氨酸蛋白酶的抑制作用达到饱和,对鱼糜的凝胶质构等方面不再有显著的影响。本研究为半胱氨酸蛋白酶抑制剂大规模生产及其在鱼糜制品中的利用提供了理论依据。