内分泌干扰物(endocrine disrupt chemicals,EDCs)是一类影响生物体内分泌系统正常调控,干扰体内激素合成、转运、释放与代谢的化合物,具有隐蔽性、迁移性、蓄积性和持久性等特点,其中以双酚A(BPA)、双酚AF(BPAF)和四溴双酚A(TBBPA)等双酚类化合物(bisphenol compounds,BPs)为典型代表。由于BPs广泛存在于食品与环境之中,使人类内分泌系统等诸多环节异常,且均有诱导雌激素受体(estrogen receptor,ER)转录活性的潜在作用,因此又被称为环境雌激素。随着我国城市化与工业化的快速发展,食品安全问题和环境污染问题越加凸显,而且由于环境体系和食品供应链体系本身的复杂性以及二者之间的通联性,具有内分泌干扰作用的BPs的种类将更为繁多,相互作用也将会变得更为复杂,会对人体健康造成严重威胁。因此需要建立一种具有广谱性、灵敏性和易操作性的多残留检测方法来对环境和食品中的BPs进行监测。本文的主要研究内容和结果如下:(1)可溶性雌激素受体α配体结合域(estrogen receptor α ligand binding domain,ERα-LBD)蛋白的制备运用基因重组技术,构建ERα-LBD-GST融合表达载体,在诱导温度为20℃,IPTG浓度为0.5 mM,220 rpm振摇过夜的最佳诱导条件下,目标蛋白主要呈可溶性表达,最后通过亲和纯化获得目的蛋白ERα-LBD,以期为下一步检测体系的建立提供识别元件。(2)基于ERα-LBD的BPs荧光偏振检测方法建立及应用以成功制备的ERα-LBD重组蛋白为识别元件,coumestrol(CS)为探针,建立BPs的荧光偏振多残留检测方法。通过荧光偏振检测体系优化,确定10nM探针与250 nM ERα-LBD可在此检测体系中达到较好的灵敏度。在最优条件下建立23种BPs与探针的竞争性结合曲线,IC50值范围0.11-123.70μM。分别对土壤、罐装饮料和尿液三种基质进行添加回收试验,结果表明检测方法精密度与准确度良好。此外,经优化样品前处理步骤,本方法对土壤中BPA的检测限为0.05 mg/kg,低于欧盟的限量标准(0.6 mg/kg);对罐装饮料中单种双酚-二缩水甘油醚的检测限,均低于欧盟的限量标准(1 mg/kg),适用于实际样品检测。最后,将荧光偏振方法检测结果与LC-MS/MS检测结果进行比较验证,两种方法具有较高相关性,证明荧光偏振检测结果真实可靠。(3)基于ERα-LBD受体分析法的广谱性机理研究广谱性是生物类多残留检测方法中重要的评价指标,因此对广谱性现象的系统研究具有重要意义。本章结合分子表面静电势分析法和两种药效团建模方法,分别从不同角度阐明BPs在基于ERα-LBD检测方法广谱性的内在机理。首先,通过观察2D分子结构图和分子表面静电势发现,BPs不仅具备由碳或硫原子桥连2个羟苯基这一共性结构骨架,而且由于卤素原子的吸电子效应,随卤素取代基种类、位置与数量的不同,BPs分子表面静电势也成规律性变化。在此观察基础上,通过基于分子共同特征药效团(HipHop)和基于复合物药效团(Receptor-Ligand Pharmacophore Generation)建模发现,除 BPs 两端的轻基均与氢键受体(HBA)药效特征基团叠合外,同时也基于受体结构得到疏水基团(HY)的正电离子化基团(PI)两种药效特征基团,说明与氢键相互作用一道,疏水作用和静电相互作用也在不同程度的影响着BPs和ERα-LBD相互作用,并对基于ERα-LBD受体法的广谱性做出贡献。(4)BPs与ERα-LBD结合力构效关系研究为进一步阐明BPs与ERα-LBD结合力的内在影响因素,以本实验测得的BPs与ERα-LBD结合力为原始数据,构建基于静电场和立体场的3D-QSAR模型,结果显示训练集化合物理论预测值与实验值线性关系为Y=0.9939X+0.0309,R2 为 0.9939,测试集化合物线性方程为 Y=0.9342X+0.1953,R2 为 0.7565,表明构建的3D-QSAR模型具有良好的预测能力。此外,运用分子对接技术,将BPs分别与ERα-LBD进行对接,通过归纳与总结发现23种BPs可大体分为两类结合模式:一是以BPA、TCBPA和BPS为代表的与激动剂E2类似的结合模式,此类化合物主要与ERα-LBD中的Glu353,Gly521,His524等重要氨基酸形成氢键,从而能够稳定地锚定在疏水结合腔内;二是以HPTE、BPAF和BADGE-2H20为代表的与拮抗剂OHT类似的结合模式,即此类化合物一条侧链伸进螺旋H3和螺旋H11的通道,并与THR347和(或)ASP351形成氢键。综上所述,本文以可溶性ERα-LBD为识别元件,建立BPs多残留荧光偏振检测方法,同时对方法的基质效应和添加回收率等进行研究,并用LC-MS/MS对荧光偏振检测结果进行验证。此外,利用药效团、分子对接和3D-QSAR等研究方法,从化合物分子结构和化合物在受体内特征结合构象上,研究ERα-LBD与BPs的相互作用模式差异,揭示受体分析法的内在机理。本项研究的开展,为BPs的高通量筛查与检测提供了新的研究思路和可靠理论依据,为开发可推广BPs多残留检测试剂盒奠定了良好的基础,也为后续方法进一步优化与创新提供理论支撑和有益借鉴。