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目的c-Maf是AP-1碱性亮氨酸拉链转录因子家族中的一员。它可以和家族中的其他成员形成同源或异源二聚体,通过结合到Maf识别元件(MARE)上,实现对靶基因的调控。临床数据分析显示,在许多多发性骨髓瘤(MM)病人样本中都可以检测到c-Maf的高表达,c-Maf是MM的致癌基因和不良预后因子。已有研究表明,c-Maf可以通过泛素-蛋白酶体途径降解,但其具体机制还不是很清楚。本研究的目的就是寻找抑制c-Maf泛素化修饰的去泛素化酶,并探究其作用机制和对MM的影响。方法(1)利用质谱学方法分析与c-Maf相关蛋白,寻找可能存在的去泛素化酶。(2)运用免疫共沉淀技术验证质谱结果,并通过激光共聚焦显微镜观察c-Maf与OTUB1在细胞中的分布,验证c-Maf和OTUB1是否存在共定位。(3)运用放线菌酮和蛋白质免疫印迹方法检测OTUB1对c-Maf稳定性和半衰期的影响。(4)构建OTUB1功能部位的缺失或功能位点突变的突变体,探究OTUB1发挥功能的区域。(5)构建c-Maf赖氨酸单点突变的突变体,检测OTUB1的主要作用位点。(6)利用荧光素酶为报告基因分析OTUB1对c-Maf和MafA转录活性的影响。(7)制备OTUB1的慢病毒并侵染多发性骨髓瘤细胞,探索过表达OTUB1对内源性c-Maf蛋白表达以及对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响。结果(1)采用质谱学分析c-Maf的免疫共沉淀复合物,发现其中存在去泛素化酶OTUB1。c-Maf相关蛋白中被质谱识别了六个OTUB1的特异性肽段,序列覆盖率为26%,提示OTUB1可能与c-Maf结合。(2)在HEK293T细胞中过表达OTUB1和c-Maf,co-IP检测到OTUB1和c-Maf结合。构建OTUB1慢病毒并侵染多发性骨髓瘤细胞后,co-IP检测到内源性OTUB1和c-Maf可以相互结合。并且在HEK293T细胞株中过表达c-Maf和OTUB1后,通过激光共聚焦显微镜观察发现OTUB1和c-Maf在细胞核中存在共定位。(3)在HEK293T细胞中过表达OTUB1,IP结果发现OTUB1使c-Maf的泛素化水平降低;在MM细胞株RPMI-8226中侵染OTUB1慢病毒后,发现OTUB1也能使内源性c-Maf泛素化水平降低。在MM细胞中采用siRNA敲低OTUB1后,c-Maf的泛素化水平又能部分恢复,进一步提示OTUB1对c-Maf泛素化的调控作用。在HEK293T细胞中转染MafA、MafB和OTUB1后,IP结果显示OTUB1可以显著抑制MafA的泛素化,但对MafB的泛素化没有影响。(4)在HEK293T细胞中过表达不同浓度的OTUB1和MafA、MafB、c-Maf,WB结果发现OTUB1可以显著上调MafA和c-Maf的蛋白水平,对MafB没有显著影响;在MM细胞株中敲低OTUB1的表达后,发现c-Maf的蛋白水平降低。而在采用CHX处理细胞后发现c-Maf半衰期为6-8h,而共转OTUB1后,c-Maf的半衰期为12小时,说明OTUB1显著延长了c-Maf的半衰期。这些进一步提示OTUB1通过介导c-Maf的泛素化而调控了其蛋白稳定性。(5)在HEK293T细胞中过表达OTUB1和c-Maf的赖氨酸突变体,检测其蛋白表达水平发现OTUB1不能诱导c-Maf K85R,K283R和K347R突变体蛋白的表达,说明其主要作用于c-Maf的K85,K283和K347赖氨酸位点上。构建OTUB1的关键氨基酸残基的突变体后,检测其对c-Maf泛素化水平影响,结果发现OTUB1的71位赖氨酸K71是OTUB1发挥去泛素化功能所必须的氨基酸。(6)构建Maf特异性响应单元驱动的荧光素酶(pGL4-MARE-Luc),检测OTUB1对Maf的转录活性的影响,结果发现OTUB1能促进c-Maf和MafA的转录活性,与c-Maf和MafA的泛素化和蛋白稳定性一致。(7)用OTUB1慢病毒侵染MM细胞株,随着病毒滴度的增加,内源性c-Maf蛋白水平表达逐渐升高,通过MTT方法检测细胞的增殖率发现过表达OTUB1后,促进MM细胞的增殖。结论:OTUB1能够与c-Maf结合,并抑制c-Maf的多聚泛素化,其中OTUB1主要作用于c-Maf的K85、K283、K347这三个赖氨酸位点。此外,OTUB1的K71位赖氨酸是OTUB1发挥去泛素化作用所必须的功能氨基酸。并且,过表达OTUB1可以上调内源性的c-Maf,并促进了多发性骨髓瘤细胞的增殖,而敲低OTUB1则能促进c-Maf的降解。这些结果提示靶向OTUB1能够促进c-Maf蛋白的降解,抑制OTUB1可能是治疗MM的手段之一。