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双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶 1A(dual-specificity tyro-sine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase 1A,DYRK1A)在胰腺癌以及糖尿病中高表达并异常激活,与肿瘤的发生发展以及胰岛β细胞的增殖密切相关。因此,靶向DYRK1A抑制剂的研发成为治疗胰腺癌和糖尿病的一个新的研究方向。首先通过基因工程技术对重组人源性DYRK1A蛋白进行表达纯化,获得了大量且高纯度的重组人源性DYRK1A蛋白;利用重组DNA技术将DYRK1A目的基因构建到新的表达载体pNIC28-Bsa4上,并实现了 DYRK1A基因的稳定存在和高效克隆。利用课题组从甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)和瘤毛獐牙菜(Swertia pseudochinensis Hara)植物中提取分离得到的天然产物小分子化合物,通过体外激酶实验筛选得到了DYRK1A抑制剂,其中异戊烯基取代的化合物甘草香豆酮(licocoumarone,LC)和根据去甲基雏菊叶龙胆酮(demethylbellidifolin,DMB)结构改造通过化学合成得到的化合物2-2首次报道为潜在的DYRK1A抑制剂,在分子水平对DYRK1A酶活抑制的IC50值分别为12.56μM和3.44 μM。分子对接显示该化合物可有效的占据DYRK1A的活性位点,几乎完全占据了 DYRK1A的整个活性口袋,并预测了化合物与DYRK1A靶标蛋白的结合方式。对LC与DYRK1A两者之间结合力的研究显示,LC与靶点蛋白DYRK1A具有较强的结合亲和力,其解离常数(Kd)为14.90 μM。对LC直接靶点验证的结果显示,LC能够增强靶标蛋白DYRK1A抗链霉蛋白酶水解的作用。对BxPC-3胰腺癌细胞增殖抑制的结果显示,LC可有效抑制DYRK1A过表达的细胞株的细胞增殖效应,且无细胞毒性。研究表明,LC可诱导BxPC-3胰腺癌细胞发生凋亡,降低细胞存活率。对BxPC-3胰腺癌细胞给药前后蛋白表达水平的检测结果显示,LC可能通过抑制DYRK1A,降低c-MET蛋白的表达水平。生物电子等排取代对化合物DMB进行结构改造,得到新化合物2-1和2-2。结合体外激酶活性和MST结合力实验,对DYRK1A小分子抑制剂构效关系的分析结果显示,羟基很有可能是化合物的关键药效团;氢键以及疏水相互作用力对复合物结构的稳定性具有重要作用。本研究建立多成分-单靶点的筛选模型,用于DYRK1A小分子抑制剂的发现。综上所述,本研究通过将分子对接与小分子化合物数据库进行有机结合,结合蛋白质生物化学、药理学实验、化学合成等技术,筛选得到针对重大疾病靶点DYRK1A的先导化合物,本研究首次将licocoumarone以及2-2确定为天然的DYRK1A抑制剂,可作为肿瘤与糖尿病治疗的潜在先导化合物。