葡萄糖氧化酶(GlucoseoxidaseGOD)是一种需氧脱氢酶，它能专一地氧化B—D一葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。由于GOD与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了它在科研、医药和工业生产上广泛的应用。 马铃薯、番茄、辣椒、大蒜、白菜、萝卜及瓜类等真菌病害严重，尤其是南方湿热条件更为严重，占总病害的80％以上。有关植物——病原微生物互作机制的研究表明，植物有许多诱导防卫机制，可表现出多种多样的生理生化抗菌途径。抗真菌蛋白的产生和积累是一种主要的防卫反应。这些蛋白质对真菌的生长有直接或间接的抑菌效应，所以抗真菌蛋白基因工程策略已成为培育作物广谱抗性的一种有效方法。近年来一些科学家致力于利用基因工程方法，培育新的抗病品种，目前转GOD基因的番茄、小麦、棉花、草莓、马铃薯、水稻等的培育已经显示了很好的抗性。 本研究首次采用国内具有高活性的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株3．324为材料，克隆出1．8kb的GOD基因片段，并比较分析了其结构，为GOD基因的进一步应用提供条件：构建了两个原核表达载体，为该基因在原核表达载体中的表达、蛋白测定、制备抗原和在植物表达载体构建、转基因研究等奠定了基础。主要取得如下结果： 1.从黑曲霉3．324菌株中提取了高质量的基因组DNA：利用PCR技术，以黑曲霉基因组DNA为模板，扩增得到目的基因片段，经连接、转化将其克隆到pGEM—Teasy载体中，转入大肠杆菌DH5Q感受态细胞中，经蓝白斑、琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR扩增以及限制性内切酶分析，鉴定出4个阳性克隆，并将含全长GOD基因的重组质粒命名为pGEM／G0，然后进行序列测定。 2．在序列分析基础上，将黑曲霉3．324的GOD基因的一级结构与黑曲霉3．758的葡萄糖氧化酶基因的一级、二级和高级结构进行了比较研究，分析了其总的核苷酸的改变情况及其同源率。同时对其N、C端及中间部分的一级结构进行了分析，并发现其中部核苷酸及氨基酸的同源率明显低于N端和C端。目前尚未见有关黑曲霉GOD基因一级结构的比较研究方面的报道。用RNAstructure软件分析了所克隆的3．324GOD基因及3．758GOD基因的二级结构，用DNAclub软件分析了GOD基因的限制酶切图谱。结果表明3．324GOD基因与3．758GOD基因在结构上存在一定差异：在一级结构中有35个碱基不同，导致8个氨基酸发生变化；GC％含量下降为57．9，这可能是3．324GOD比3．758GOD基因容易扩增的原因；同时，3．758GOD基因在561位有一琥珀无义突变，形成终止子，阻断了蛋白的表达，这可能是是3．758没有活性而3．324高活性的一个原因。 3．在线比较研究了与其它不同来源的GOO基因的一级结构和在线分析了克隆基因所编码的蛋白同源性 把克隆到的GOD基因通过GenBank(http：／／WWW．ncbi．nlm．nih．gov／)上的Blast工具进行基因同源性比较分析，发现得到的GOD基因与登录的其他5个GOD基因同源率在90％以上。把克隆得到的GODDNA序列推导出的氨基酸序列通过EMBL-EBI的Blast2在线比对软件进行氨基酸同源性分析发现，我们得到的GOD基因和其它同源基因所编码的氨基酸高度类似，与其它5个基因同源性在79％以上 4．利用重组质粒pGEMT／G0构建pET／G0和pQE／G0重组质粒。根据Frederick(1990)报道，黑曲霉GOD基因结构无内含子，无HindIII、BamHI位点。分别用Hind[II、Ba~zkl[双酶切pGEM／G0、pET一2la(+)矛pQE质粒，采用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片断，前者回收1.8kb的GODDNA片段，后者回收线性化的pET-21a(+)和pQE片段，将两者分别连接后转化大肠杆菌JMi09，抽提的重组体质粒命名为pET／GOD和pQE／GOD。经质粒电泳、PCR和酶切鉴定成功地构建了2个原核表达载体。应用所设计的上游引物Bank[I酶切位点和下游引物HindIII酶切位点，将葡萄糖氧化酶基因片段定向连接到质粒pQE、pET-21a(+)的相应位点，保证了插入片段方向的正确性。 本试验的成功为GOD基因的进一步利用、基因的表达及进一步阐明GOD基因结构与功能的关系、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素研究、植物抗氧化系统分子调控机制的研究和基因工程方法及改良植物的抗病性的研究奠定了基础。