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目的:在多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)疾病中,骨髓微环境对MM细胞的生存、耐药、演化等起着重要的支持作用。骨髓微环境中常有各种炎症相关因子水平异常,这些炎症因子除了直接作用于MM细胞外,其如何通过微环境中骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)来影响MM细胞,目前尚未完全阐明。本研究在体外研究炎症因子作用微环境中BMMSCs后,其对MM细胞对多西环素(Doxycycline,DOX)杀伤作用敏感性的变化,以及可能涉及的部分机制。方法:1.用CCK8法检测不同时间(1天、2天、3天)不同浓度多西环素(DOX)处理H929或BMMSCs后的细胞增殖活性抑制作用,筛选出适宜的多西环素浓度梯度。然后再用白细胞介素-1β(IL-1β)或肿瘤坏死因子-1α(TNF-α)预处理BMMSCs后,利用CCK8法检测在与BMMSCs共培养条件下,DOX对骨髓瘤细胞株H929的增值抑制作用,随后与对照组的数据进行比较,并进行统计学分析。2.应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测IL-1β或TNF-α处理后,对BMMSCs的VCAM-1与BAFF基因m RNA的表达影响。分为1)对照组a:无处理BMMSCs。2)实验组b:BMMSCs用IL-1β处理1天(24h)。3)实验组c:BMMSCs用TNF-α处理1天(24h)。用Real-Time PCR方法检测各组基因的变化,并进行统计学分析。3.首先,利用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分别检测在予炎症因子IL-1β或TNF-α处理后,对BMMSCs表面的VCAM-1的表达的影响。然后,先将BMMSCs予IL-1β或TNF-α预处理后,再用FCM方法检测H929细胞与BMMSCs共培养条件下,不同DOX浓度下H929凋亡的变化。随后与对照组的数据进行比较,并进行统计学分析。4.先将BMMSCs予IL-1β或TNF-α预处理后,采用Western Blot方法检测H929细胞与BMMSCs共培养时,不同浓度多西环素条件下,H929细胞p-Erk1/2的表达的情况,随后与对照组的数据进行比较,并进行统计学分析。结果:1.置于显微镜下观察,不论是否有IL-1β或TNF-α处理,BMMSCs的生长方式均是贴壁生长,细胞形态大致主要为长梭形状。不论是否有IL-1β或TNF-α处理,各组的BMMSCs形态无明显的差异。与H929细胞株共培养后,BMMSCs的细胞形态和生长特点与单独培养时比较,也无明显形态学改变。2.根据DOX对H929细胞的增殖抑制曲线,筛选出5和10μg/m L的DOX浓度作为下一步的体外实验检测浓度。在5和10μg/m L的DOX浓度下,对BMMSCs的增殖没有明显影响(P>0.05)。不论是在5或10μg/m L的DOX浓度下,H929与BMMSCs共培养后,与对照组比较,经过IL-1β或TNF-α预处理的BMMSCs,可以减少DOX对H929细胞的体外增殖抑制(均P<0.05)。3.不论是经炎症因子IL-1β还是TNF-α处理后,炎症因子处理组与对照组比较,RT-PCR检测提示BMMSCs的VCAM-1的m RNA表达水平上调且具有统计学意义(P<0.05);但是经IL-1β或TNF-α处理后对BMMSCs的BAFF的m RNA表达没有明显变化(P>0.05)。4.用IL-1β或TNF-α处理BMMSCs后,FCM检测提示表达VCAM-1的细胞比例较对照组明显增多(P<0.05)。在IL-1β和TNF-α处理组比较中,发现TNF-α组比IL-1β组的VCAM-1细胞阳性率更高(P<0.05)。在5μg/ml的DOX浓度下,与无共培养的对照组相比,H929与BMMSCs共培养条件下,可以降低H929细胞凋亡率(P<0.05);但在10μg/ml的DOX浓度下,共培养组与对照组间的H929细胞的凋亡率没有明显差异(P>0.05)。随后在BMMSCs经IL-1β或TNF-α预处理的情况下,H929与BMMSCs在5或10μg/ml DOX下共培养2天后,经炎症因子预处理组中的H929的凋亡率减少(P<0.05)。且TNF-α组比IL-1β组的降低H929细胞凋亡率的作用更显著(P<0.05)。5.首先,DOX处理后可使H929细胞的p-Erk1/2表达,经Western Blot方法检测后发现其水平下降,在实验浓度下不具有剂量依赖性。其次,H929与BMMSCs共培养时,经DOX处理后H929的p-Erk1/2水平,较无共培养的对照组有所上调(P<0.05)。最后,在与经IL-1β或TNF-α预处理的BMMSCs共培养条件下,DOX处理后H929的p-Erk1/2水平,较无炎症因子处理的对照也有所上调(均P<0.05)。结论:我们的体外研究结果提示,在经炎症因子如IL-1β和TNF-α作用BMMSCs以后,刺激后的BMMSCs与MM细胞株相互作用中,可以减少DOX引起H929细胞的增殖抑制和凋亡,增加MM细胞株对DOX的耐药。炎症因子这一作用可能与其对BMMSCs的Mek/Erk信号通路、细胞表面黏附分子VCAM-1有关。