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苏云金芽抱杆菌Bacillusthuringiensis是土壤中的一种革兰氏阳性细菌,在其芽抱形成期产生具有杀虫特性的伴抱晶体,即6内毒素。Bt制剂作为一种对人畜安全、无环境污染的微生物杀虫剂,在农林及卫生害虫的防治中发挥了重要作用;自1996年转Bt基因抗虫作物商业化种植以来,Bt的使用范围、效果和效益得到进一步拓展和提升。棉铃虫Hellicoverpa armigera(Huibner)属鳞翅目夜蛾科,是棉花等多种作物上的重要害虫,我国自1997年开始种植转Bt基因抗虫棉(简称Bt棉)以控制棉铃虫的危害。Bt棉的大面积种植不仅减轻了棉铃虫对多种寄主作物的危害,同时也大量减少了化学农药的使用,Bt棉的推广种植创造了显著的经济效益和良好的生态效益。Cry2Aa因同时具有对鳞翅目和双翅目昆虫较高的毒杀活性,是Cry毒素蛋白中较特殊的一类。它比广泛应用于农业生产的Cry1A类毒素有更广的鳞翅目昆虫毒杀谱,且与Cry1A的交互抗性水平较低。同时转入Cry1Ac和Cry2Ab毒素基因的双价Bt棉如今已广泛种植,由于两种毒素的氨基酸序列差异大,在昆虫中肠上有不同的受体,因此靶标害虫不容易对双价Bt棉产生抗性。关于Cry1A毒素的活化、作用机制和抗性机理,已有大量的研究和报道,而对Cry2A毒素相关内容的研究则较少。Cry2Aa和Cry2Ab原毒素均具有633个氨基酸,其N端的一部分序列被切除后才能转化成为活化毒素。本文系统研究并比较了 Cry2Aa和Cry2Ab在棉铃虫中肠液作用下的消解动态及酶切位点,为建立棉铃虫中肠液对Cry2Aa和Cry2Ab原毒素活化能力的定量检测方法提供了重要基础。同时,研究了本实验室建立的棉铃虫Cry2Ab抗性品系(An2Ab)和敏感品系(AY)幼虫中肠蛋白酶对Cry2Aa和Cry2Ab原毒素的活化降解过程以及中肠蛋白酶活性,均没有发现显著差异,从而表明了棉铃虫中肠蛋白酶未参与An2Ab抗性品系对Cry2Ab抗性的形成。1.棉铃虫中肠液对Cry2Aa和Cry2Ab原毒素活化位点的鉴定丝氨酸蛋白酶类是鳞翅目昆虫碱性的中肠环境中主要的消化酶,包含胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等,在Bt原毒素的活化及活化毒素降解过程中发挥重要作用。生物测定结果显示Cry2Ab对棉铃虫的毒力略高于Cry2Aa。通过SDS-PAGE分析、Cry2Aa和Cry2Ab活化毒素的N端氨基酸测序,发现Cry2Aa和Cry2Ab毒素具有不同的活化位点。Cry2Aa原毒素N端被切除49个氨基酸后转化为活化毒素,Cry2Ab原毒素N端切除139个氨基酸后转化为活化毒素;根据蛋白酶切除位点前一个氨基酸推测,Cry2Aa原毒素的活化主要由胰凝乳蛋白酶完成,而Cry2Ab原毒素的活化则主要由胰蛋白酶承担。2.棉铃虫Cry2Ab抗性和敏感品系幼虫中肠蛋白酶活性的比较作为鳞翅目昆虫中肠主要的消化酶,丝氨酸蛋白酶性质和活性的改变通过影响Bt原毒素的溶解活化及活化毒素的降解过程而与Bt抗性的产生密切相关。本实验室建立的棉铃虫An2Ab抗性品系对Cry2Ab原毒素具有140倍抗性,为了明确中肠蛋白酶是否参与Cry2Ab抗性的形成,本文开展了以下研究:比较了 Cry2Ab抗性、敏感品系棉铃虫中肠总丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶活性,发现两品系蛋白酶活性差异不显著;SDS-PAGE分析棉铃虫中肠液对Cry2Aa和Cry2Ab原毒素的活化及活化毒素的降解过程,发现棉铃虫抗性品系中肠液对两种毒素的水解过程均略快于敏感品系,但差异不显著;通过Native-PAGE酶谱分析棉铃虫抗性、敏感品系中肠蛋白酶,发现两品系酶谱无显著差异。上述结果表明,棉铃虫An2Ab抗性品系幼虫中肠蛋白酶对Cry2Ab原毒素的活化和降解未产生明显改变,与Cry2Ab抗性的形成关系不大。