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研究背景心肌肥厚是心脏在压力超负荷情况下对心肌收缩力和心脏功能的一种适应性反应,可分为生理性和病理性。前者是指心脏受到长期运动、妊娠等活动的生理性刺激引起;后者则是受到高血压、心肌梗死、基因多态性、糖尿病等慢性病理性刺激时引起的一种代偿性反应。病理性心肌肥厚随着病情的进展,心室肌可发生结构重构、离子通道重构（电重构）以及Ca2+重构,心脏功能渐由代偿期转为失代偿,可导致心血管不良事件的发生。其中,心肌电重构使肥厚心肌易发生早期和晚期后除极,导致恶性心律失常和猝死的发生。因此,探索病理性心肌肥厚电重构及各种因子之间相互作用的分子机制,寻找有效防治策略迫在眉睫。小电导钙激活钾通道（small conductance calcium-activated potassium channel,SK）在哺乳动物的可兴奋细胞有广泛表达,具有K+高度选择性,对Ca2+高敏感性以及非电压依赖性三大特性。根据编码基因的不同,SK通道可分为SK1、SK2、SK3和SK4四种亚型,其中,SK1,SK2和SK3可表达在心肌组织。研究表明,SK2通道在生理情况下主要表达在心房肌细胞,参与动作电位复极化的构成,在心肌肥厚和心力衰竭等心脏疾病中出现表达上调,且心室表达显著增加,目前对于心肌肥厚时心室SK2表达上调的机制并不明确。我们实验室前期工作,已通过免疫共沉淀和pull-down实验证明小鼠心肌细胞Junctophilin-2（JPH2,JP2）和SK2有相互作用,细胞免疫荧光实验也显示JP2和SK2在心房肌、心室肌和转染的HEK293细胞都有共定位,且敲减小鼠心肌细胞JP2基因显示SK2通道电流显著降低,钙瞬变的峰值也明显降低,这表明JP2可能通过细胞内Ca2+水平影响SK2通道电流。Junctophilin（JPs）是横纹肌和神经元等可兴奋细胞的耦联膜复合物中表达的蛋白质,桥接质膜和肌/内质网（endoplasmic reticulum/sarcoplasmic reticulum,ER/SR）之间的亚细胞空间。可分为JP-1、JP-2、JP-3和JP-4四种亚型,主要位于心肌和骨骼肌的JP2可以调节细胞内钙离子稳态和维持横管结构。有研究显示,在心肌肥厚和心力衰竭等疾病中心脏JP2表达是下调的,心肌肥厚动物模型的心肌样本也显示JP2表达下降,有序的T-管结构破坏,Ca2+瞬变降低,兴奋-收缩耦联减弱;而特异性敲减小鼠心脏JP2可导致心肌肥大以及急性心力衰竭的发生;此外,有研究已鉴定出易感肥厚性心肌病的四种JP2突变子,突变位点分别是S101R,Y141H,S165F和A405S。因此,已有的研究表明在心肌肥厚时SK2和JP2的表达均有改变,那么二者的重构之间是否有关系,目前尚未有相关研究。研究目的本实验拟通过血管紧张素Ⅱ诱导构建H9c2肥大心室肌细胞模型,观察肥大细胞的SK2通道电流是否有变化,以及JP2敲减和过表达后对SK2通道电流的影响,从而在体外检测心肌肥厚中JP2对SK2通道功能的影响,为探索病理性心肌肥厚及电重构的分子机制提供理论基础。研究方法1.设计JP2 m RNA的靶向序列,制备JP2过表达重组腺病毒表达载体;靶向JP2敲减的si RNA是实验室已长期使用冻存的。2.通过Western bloting方法检测转染腺病载体的H9c2细胞JP2蛋白表达水平。3.H9c2细胞传代24小时后,加入血管紧张素Ⅱ,构建心室肌细胞肥大模型,培养24小时后,在倒置显微镜下观察细胞,测量细胞面积,并采用Western bloting方法测定B型脑钠肽（B-type natriuretic epeptide,BNP）蛋白的表达水平。4.实验分为六组:A组:Control组,正常的H9c2细胞作为空白对照组;B组:Ang Ⅱ肥厚组,血管紧张素Ⅱ诱导的肥大H9c2细胞组;C组:Ang Ⅱ+Ad-NC-si JP2组,敲减阴性对照组,肥大组细胞转染JP2敲减阴性腺病毒载体;D组:Ang Ⅱ+Ad-si JP2组,肥大组细胞转染JP2敲减腺病毒载体;E组:Ang Ⅱ+Ad-NC-JP2OE组,肥大组细胞转染JP2过表达阴性腺病毒载体,作为过表达阴性对照组;F组:Ang Ⅱ+Ad-JP2OE组,肥大组细胞转染JP2过表达腺病毒载体;5.六组细胞采用全细胞膜片钳法记录SK2通道电流,对转染细胞观察到绿色荧光的才进行实验。实验结果1.PCR和阳性克隆测序证明了JP2过表达腺病毒载体构建成功。2.Western bloting检测显示,Control组、Ad-NC-si JP2和Ad-NC-JP2OE组的JP2表达没有显著差异,Ad-si JP2组JP2蛋白表达比Ad-NC-si JP2组显著降低（P值为0.0289）,Ad-JP2OE组JP2蛋白表达明显高于Ad-NC-JP2OE组（P值小于0.0001）,这一结果提示病毒载体成功转染H9c2细胞,而且有效的敲减和过表达了H9c2细胞JP2。3.在倒置显微镜下观察10-7mol/L血管紧张素Ⅱ处理的H9c2细胞,细胞明显变大,BNP蛋白表达量显著增加（P值为0.0161）,表明H9c2肥大细胞模型构建成功。4.各组H9c2细胞电流密度-电压关系曲线显示apamin敏感的SK2通道电流具有内向整流的特性。Ang Ⅱ诱导的H9c2肥大细胞的SK2通道电流密度明显大于Control组;敲减JP2蛋白会明显增加H9c2肥大心肌细胞SK2通道电流密度;而过表达JP2会使H9c2肥大细胞的SK2通道电流密度显著降低。血管紧张素Ⅱ诱导的H9c2肥大心肌细胞SK2通道电流增加,JP2表达水平的变化会影响SK2通道电流大小。