ALV--A感染DF--1细胞部分微卫星不稳定性与错配修复相关基因研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:llsnow_2009
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禽白血病是家禽三大肿瘤性疾病之一,呈世界性分布,是由禽白血病病毒/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSV)所引起的一类禽肿瘤性疾病,在鸡群中普遍存在。目前国内外多数是针对禽白血病病毒进行研究的,但对于ALV感染后宿主基因组DNA的变化和DNA损伤后错配修复相关基因的表达变化的研究鲜有报道。本试验对ALV-A病毒感染DF-1细胞后部分微卫星不稳定性和错配修复基因表达情况进行研究,旨在从宿主基因组变化的角度为禽白血病的早期诊断及肿瘤的分子发病机制提供线索。  试验一,ALV-A病毒的扩增及ALV-A感染DF-1细胞后细胞周期、细胞凋亡检测。ALV-A(RAV-1株)病毒冻干粉溶解稀释后接种DF-1细胞,维持培养7d,测其病毒含量为10-4.75TCID50/0.1ml;细胞周期失控,G1期细胞减少,S期细胞增多,G2细胞增多,影响DNA的复制;细胞凋亡率并无明显变化,DNA合成受阻,这为后续微卫星不稳定和错配修复相关基因研究奠定了试验基础。  试验二,ALV-A病毒液接种DF-1细胞,提取细胞基因组DNA,选取16个微卫星位点,通过PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、测序等技术检测微卫星不稳定性。试验组与对照组未发现有微卫星条带差异,且核心序列比对未见异常。  试验三,ALV-A病毒液接种DF-1细胞,提取细胞基因组DNA,根据MSH2基因的16对外显子序列和MLH1的19对外显子序列设计引物,采用PCR反应、8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术检测基因突变情况;提取细胞内总RNA,以β-acting为内参引物,检测MSH2、MSH3、MLH1和PMS1基因mRNA表达水平变化。结果显示MSH2和MLH1外显子均未发现基因突变;MSH2基因mRNA表达量增加,差异显著(P<0.05);MLH1基因mRNA表达量增加,差异极显著(P<0.01);MSH3和PMS1基因mRNA的表达也增加,但差异不显著(P>0.05)。
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