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集胞藻PCC6803是一种既可以利用光能营自养生活、又能利用环境中的糖类营异养生活的单细胞原核生物,以多细胞聚集的群体形式存在。随着蓝藻基因工程学的发展,已经成为重要的工具菌和光合作用机制等生物过程研究的模式生物。蓝藻中的藻胆蛋白是蓝藻光合作用重要的捕光元件,对于细胞的生长、繁殖有重要的生物学意义。在体内,藻胆体的装配和藻胆蛋白的生物合成是一个高度有序的过程,需要各种酶的催化。2006年,Shen等研究发现聚球藻PCC7002中的cpcT基因所编码的蛋白可以催化藻蓝蛋白的生物合成,即有藻蓝蛋白裂合酶的功能。本实验通过同源性分析发现,集胞藻PCC6803中基因slr1649与cpcT序列有50%相似,为了进一步探讨其功能,特采用了两种方法构建同源缺失突变载体:方法一,通过PCR扩增得到目的基因上下游片段作为同源臂构建克隆载体,在两个同源片段中间插入筛选标记;方法二,构建目的基因的克隆载体,通过点突变引入酶切位点并在克隆载体中插入筛选标记。两种方法相比,方法一操作繁琐,但同源臂较长,可以提供基因敲出操作的成功率。集胞藻PCC6803有天然的吸收外源DNA的能力,利用这一特性将突变载体转入蓝藻细胞中,通过抗性平板的筛选得到基因缺失突变株。将基因缺失突变株转入BG11液体培养基中,与野生型蓝藻对照培养,观察其表型变化。
实验对集胞藻PCC6803中基因slr1649的功能进行了初步探讨,结合实验结果与同源性分析可知,此基因所编码的蛋白在生物体内的主要功能是催化色素集团与脱辅基藻胆蛋白的共价结合,对于生物体中藻蓝蛋白的生物合成具有重要意义。
针对于藻胆蛋白裂合酶的研究目前已非常广泛,已经发现cpcT、cpeT、cpcE及 cpcF等基因均有此功能,而藻蓝蛋白作为重要光合作用元件,了解并掌握其生物合成机制,对于研究光合作用机制、蓝藻细胞生理打下了基础,并为蓝藻引发的水华的治理有重要的指导意义。