论文部分内容阅读
目的:本实验以黑色素瘤B16细胞接种于C57BL/6雌鼠背部,建立小鼠黑色素瘤模型。体外应用C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1(BABL/C×C57BL/6的杂交子一代,雌性)脾脏来源的树突状细胞负载肿瘤全抗原与半相合效应性淋巴细胞共培养,随后检测效应细胞体外杀伤黑色素瘤效应。然后经过磁珠分选纯化后富集分泌IFN-γ的半相合效应细胞,将其作用于荷瘤C57BL/6雌鼠体内,检测纯化后的半相合效应细胞对肿瘤微环境中炎性因子IL-2及IFN-γ的影响,观察各组小鼠肿瘤体积变化,生存期,GVHD程度,为肿瘤微环境干扰介导的细胞免疫治疗技术在临床的应用提供新的理论依据和实验数据。方法:1体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞,建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型。2 C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1来源负载全肿瘤抗原DC的制备:取C57BL/6、CB6F1小鼠骨髓细胞,体外贴壁分选后加入rm GM-CSF、rm IL-4、黑色素瘤B16细胞冻融抗原,TNF-α诱导培养肿瘤抗原致敏的成熟DC(matured DC,m DC)。3磁珠分选效应性T细胞的制备:将CB6F1小鼠脾细胞,经淋巴分离液分离获得淋巴细胞,尼龙毛柱吸附法收集T淋巴细胞。培养T淋巴细胞2天后,加入肿瘤抗原致敏的成熟DC,混合培养3-4天,即可获得肿瘤抗原刺激后的活化效应性T细胞。应用磁珠阳性分选方法富集上述活化半相合基因效应T细胞中分泌IFN-γ的半相合效应细胞。4 CCK-8法检测三组效应性T细胞体外杀伤实验:将(A组)CB6F1来源DC和(B组)C57BL/6来源DC及(C组)二者混合的DC诱导产生的CTL(作为效应细胞,E)分别与小鼠黑色素瘤B16细胞(作为靶细胞,T)按E∶T=50∶1、20∶1和10∶1的比例混合后孵育24 h,加入CCK-8试剂(20μL/孔),酶标仪检测各孔450 nm波长的A值,并计算效应性T细胞对肿瘤细胞的杀伤率。5实验动物分组及治疗:将荷瘤小鼠C57BL/6完全随机分至3组,每组40只。(A组)荷瘤对照组:每只荷瘤小鼠鼠尾静脉注射0.2ml生理盐水;(B组)环磷酰胺治疗组:每只荷瘤小鼠腹腔注入(100mg/kg)环磷酰胺;(C组)磁珠分选纯化半相合CTL治疗组:每只荷瘤小鼠鼠尾静脉注射0.2ml(1×106个/0.2ml)磁珠分选富集的IFN-γ阳性CB6F1来源效应性T细胞。观察治疗后各组荷瘤鼠肿瘤体积变化及生存期。6分别在细胞治疗后的第1、4、7、10、14天取小鼠的血清,采用ELISA法检测观察治疗后血清中IL-2、IFN-γ含量及其变化,并比较不同治疗方法对荷瘤鼠外周血中两细胞因子产生的影响。7磁珠分选纯化效应细胞治疗后第14天,HE染色观察各组小鼠瘤组织以及肝、脾和小肠组织的形态学变化。结果:1 C57BL/6小鼠经皮下接种5×106 B16黑色素瘤细胞株7天后可见小鼠皮下明显的黑色结节,直径达0.5cm。2小鼠骨髓来源DC细胞培养至第6天,倒置相差显微镜下观察发现大量具有典型毛刺状形态的成熟DC细胞悬浮在上清液中聚集成团,提示DC已经发育成熟,具备提呈抗原能力。3 CCK-8法检测不同来源DC提呈肿瘤抗原激活产生的效应性T细胞体外杀伤效率:效靶比为50:1及20:1条件下A组(CB6F1来源DC)诱导的效应性T细胞对B16细胞杀伤率优于B组(C57BL/6来源DC)及C组(混合DC),且差异具有统计学意义(P<0.05),B组及C组的杀伤率之间无显著差别(P>0.05);效靶比10:1条件下A、B、C三组效应T细胞对B16细胞杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。4各组荷瘤小鼠肿瘤体积变化:单纯注射PBS的对照组和环磷酰胺组小鼠肿瘤生长迅速,给予磁珠分选纯化的半相合基因型DC-CTL过继治疗后,小鼠肿瘤生长速度从第7天至第20天较对照组显著下降。5各组小鼠生存期:A组(荷瘤对照组),B组(环磷化疗组),C组(细胞治疗组)间生存期比较,差异有统计学意义(P<0.05)。6 ELISA法检测治疗后不同时间小鼠外周血中IL-2和IFN-γ的浓度:在磁珠分选效应细胞治疗组中血清IL-2及IFN-γ的含量明显高于荷瘤对照组(P<0.05)。荷瘤小鼠给予磁珠分选效应细胞治疗后,血清IL-2和IFN-γ含量伴随着时间的变化,出现逐渐升高的趋势,三组外周血中IL-2的浓度均存在显著性差异(P<0.05)。7 HE染色结果:各组荷瘤小鼠瘤组织内坏死面积,磁珠分选细胞治疗组和环磷化疗组明显大于对照组;观察磁珠分选细胞治疗后小鼠肝、小肠、脾脏组织中未见明显组织损伤形态学变化。结论:1在体外实验中,分别来源于CB6F1及C57BL/6的DC及两种混合DC诱导的半相合基因效应性T细胞对小鼠黑色素瘤B16细胞均能产生杀伤效应,且CB6F1来源的DC诱导的半相合基因效应性T细胞的杀伤率明显高于其他两种诱导方式,另外两种诱导方式之间的杀伤率未见统计学差异。2与环磷化疗组及荷瘤对照组比较,磁珠分选半相合基因型效应细胞治疗组7至21天小鼠肿瘤生长速度显著下降。说明磁珠分选的效应细胞对小鼠肿瘤生长具有明显抑制作用,然而,环磷化疗组与荷瘤对照组相比,其肿瘤生长抑制作用无统计学差异。3磁珠分选半相合基因效应性T细胞过继免疫治疗与环磷酰胺化疗都能够有效延长荷瘤C57BL/6小鼠的生存期,但磁珠分选细胞治疗组的生存期明显优于环磷化疗组。4磁珠分选半相合基因效应性T细胞过继免疫治疗后,可以明显提高外周血IL-2、IFN-γ的浓度,对IL-2浓度的影响优于环磷酰胺化疗组,对IFN-γ浓度的影响与环磷酰胺化疗组无统计学差别。5输注CB6F1来源的磁珠分选半相合基因效应性T细胞的荷瘤C57BL/6小鼠未出现GVHD反应。