庆大霉素是一种广泛应用于临床的氨基糖苷类抗生素,具有较强的抗菌活性和较广的抗菌谱,若使用不当会引起多器官损伤。庆大霉素进入机体会在肾脏中蓄积,从而引起肾损伤。近些年发现细胞凋亡在庆大霉素诱导的肾损伤中有重要作用,但细胞凋亡作用机制仍未阐明。MPTP的开放会导致线粒体膜通透性转换的发生,进而激活线粒体凋亡途径,但庆大霉素能否诱导MPTP开放尚不清楚。本研究以体外培养MDCK细胞为模型,通过体外试验探究MPTP在庆大霉素诱导细胞线粒体凋亡途径中的作用机制以及依达拉奉在其中的保护作用。1、庆大霉素对MDCK细胞毒性的影响为研究庆大霉素对MDCK细胞的毒性作用,不同浓度(0、2、4、8mmol/L)庆大霉素处理MDCK细胞24h以及4mmol/L庆大霉素处理MDCK细胞不同时间(0、6、12、24 h),CCK-8法测定庆大霉素对细胞存活率的影响,ELISA法检测KIM-1和NGAL损伤因子的分泌情况,流式细胞术检测细胞MPTP开放和细胞凋亡率,Hochest 33258染色观察细胞核形态的变化,免疫印迹法检测Bax和Bcl-2蛋白表达量。结果显示,与对照组相比,随着庆大霉素染毒浓度的增加和时间的延长,MDCK细胞活力呈下降趋势(P<0.05或P<0.01)。随着庆大霉素染毒浓度的增加,KIM-1和NGAL含量先升高后降低,在庆大霉素为4 mmol/L时达到分泌的峰值(P<0.05或P<0.01);随着庆大霉素染毒时间的延长,KIM-1含量先升高后下降,而NGAL含量呈上升趋势(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,随着庆大霉素染毒浓度的增加和时间的延长,MPTP开放和细胞凋亡率显著或极显著上升(P<0.05或P<0.01);细胞核出现固缩、浓染甚至碎裂的现象;Bcl-2/Bax比值显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01)。说明庆大霉素对MDCK细胞有毒性作用,存在剂量-效应关系和时间-效应关系,并且其可以诱导MPTP开放、细胞凋亡,其毒性机制可能与MPTP开放、细胞凋亡有关。2、MPTP在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡途径中的作用为研究MPTP在庆大霉素诱导MDCK细胞线粒体凋亡中的作用,本试验用4 mmol/L庆大霉素和2 μmol/L抑制剂CsA单独或联合处理MDCK细胞24 h。流式细胞术检测MPTP开放情况和细胞凋亡率;荧光检测线粒体变化和线粒体基质肿胀;JC-1探针检测线粒体膜电位的变化;免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达量、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情况、CytC和AIF释放。结果显示,抑制剂CsA能够显著或极显著抑制庆大霉素引起的MDCK细胞MPTP的开放、细胞凋亡率的上升、线粒体肿胀、ATP含量的减少、线粒体膜电位下降、Bcl-2/Bax比值下降、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化以及Cyt C与AIF的释放(P<0.05或P<0.01)。说明MPTP正向调节庆大霉素引起的MDCK细胞线粒体凋亡。3、依达拉奉在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡中的保护作用为研究依达拉奉在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡中的保护作用,本研究用4mmol/L庆大霉素和40 μmol/L依达拉奉单独或联合处理MDCK细胞24 h。Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,Hochest 33258染色观察细胞核形态的变化,比色法检测T-SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量,荧光染色检测ROS含量,免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达量、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情况以及Cyt C与AIF释放。结果显示,依达拉奉能够显著或极显著抑制庆大霉素引起的MDCK细胞凋亡率的上升;细胞核形态的改变;ROS含量的升高;T-SOD、GSH-Px活力上升,CAT活力下降,MDA含量上升;Bcl-2/Bax比值下降、caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化以及CytC与AIF的释放(P<0.05或P<0.01)。说明依达拉奉能抑制庆大霉素通过线粒体凋亡通路诱导MDCK细胞凋亡。