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本研究采用稀释涂布法与双层琼脂牛津杯打孔法对湛江南海附近海域采集的8种海洋动物肠道进行乳酸菌分离、抗菌活性测定及多相分类鉴定;利用特异性引物采用菌落PCR法对具有抗菌活性的乳酸菌进行Ⅱa细菌素菌的筛选;采用乙酸乙酯萃取、葡聚糖LH-20凝胶柱纯化、SP-Fast Flow(SP-Sepharose FF)阳离子色谱、反相半制备高效液相色谱对Ⅱa类乳酸菌素进行分离、纯化,通过2D-nano LC-MS/MS分析技术测定分子量与氨基酸序列;对纯化后的细菌素进行抗菌谱、pH、温度以及蛋白酶敏感性等特性进行评价;利用电镜观察及测定其电导率,评价细菌素对单增李斯特菌的抑制作用效果。主要结果如下:(1)从南海海域8种常见的海洋动物肠道中共分离出40株乳酸菌,通过对其中26株具有抗菌活性的菌株的16S rRNA分子生物学鉴定及系统发育分析,发现它们分属于厚壁菌门的4个科、5个属(Enterococcus、Weissella、Leuconostoc、Pediococcus、Lactobacillus),12个不同种(Enterococcus lactis、Enterococcus saigonensis、Enterococcus durans、Enterococcus dispar、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus xiangfangensis、Lactobacillus paracasei subsp.Tolerans、Leuconostoc holzapfelii、Pediococcus pentosaceus、Weissella confusa、Weissella cibaria、Weissella ghanensis),显示出较丰富的生物多样性,其中Enterococcus(50%)为优势菌属,且有4株菌为Enterococcus和Weissella属中潜在的新种。分离到的40株乳酸菌株其中26株具有抗菌活性乳酸菌对V.parahaemolytics、L.monocytogens都具有一定的抑制效果,其中9株菌同时对E.coli、V.parahaemolytics、S.aureus、L.monocytogens、B.subtilis有抗菌活性,占活性乳酸菌总数的34.6%。(2)以菌株zy-B、zy-E、zy-I、zy-F、zy-F2、zy-S6、zy-2、zy-3、zy-4等作为试验菌株,以根据Ⅱa类细菌素保守序列设计的7对特异性引物O-1、O-2、O-3、O-4、O-5、O-6与O-7进行菌落PCR扩增,对菌株进行Ⅱa类细菌素筛选。结果得到:利用7对特异性引物成功从9株活性乳酸菌中筛选到5株疑似产Ⅱa类细菌素乳酸菌,经过排酸、排过氧化氢与蛋白酶敏感试验对5株疑似产Ⅱa类细菌素乳酸菌进行验证,确认5株菌均为Ⅱa类细菌素产生菌,其中菌株zy-B具有抑菌活性强,且抗菌谱广的优点。(3)采用乙酸乙酯萃取发酵液中细菌素,乙酸乙酯与发酵液混合萃取,分离收集有机相,并在40℃旋转蒸发掉乙酸乙酯,利用25 mL PBS复溶得到细菌素粗品并测其抗菌活性,其效价为6553.6 AU/mL。将乙酸乙酯萃取的细菌素粗品依次通过LH-20凝胶色谱柱、AKTA purifier 100蛋白质纯化系统、半制备型高效液相分别进行凝胶色谱、离子交换得到了较好的分离效果,其抑菌效价依次为8192 AU/mL、4096AU/mL、5120 AU/mL,经过分析型高效液相发现在t=1.859 min出现单一抑菌活力峰,并定名为细菌素PE-ZYB1。经2D-nano LC-MS/MS测定细菌素PE-ZYB1分子量为2019.22 Da,同时二级质谱图分析N端氨基酸序列为DLFNKFNRSMQYGNGVE,通过Uniport蛋白数据库比对发现与一种未鉴定的蛋白相似性最接近,抗菌肽数据库(ADP)比对后发现此细菌素与抗菌肽Andersonin-X1(登录号:AP 01874)相似度接近,仅仅只有38.09%。推测此细菌素可能是潜在的新型细菌素。(4)对纯化后的细菌素PE-ZYB1抗菌谱研究发现对革兰氏阳性和革兰氏阴性的食源性致病菌与腐败菌均具有广谱抗菌活性,在高温下具有较高的耐热性和稳定性且在pH值2-7细菌素PE-ZYB1可以保持较好的抑菌活性。细菌素PE-ZYB1在蛋白酶敏感试验中发现对胰蛋白酶较为敏感。细菌素PE-ZYB1作用后的单增李斯特菌胞外电导率在1小时后迅速增加,这说明细菌素PE-ZYB1能非常快的对细胞膜造成损伤并且使细胞膜通透性增强。细菌素PE-ZYB1对单增李斯特菌具有杀死作用,并不是单纯的抑制作用。通过扫描电镜观察到单增李斯特菌被作用前后细胞形态发生了显著的变化,作用后的细胞发生变形、凹陷、细胞表面出现褶皱,而且细胞破裂,胞内物质溶出。这说明细菌素PE-ZYB1能对细胞膜造成孔洞从而使胞内的大分子物质泄漏,最后导致了细胞死亡。