目的:免疫耐受是免疫系统对特定抗原的特异性无应答状态,是指针对抗原特异性应答的T细胞与B细胞,在抗原刺激下,不能被激活,不能产生特异性免疫效应细胞及特异性抗体,从而不能执行正免疫应答的现象。免疫耐受的诱导、维持和破坏影响着许多临床疾病的发生、发展和转归。诱导抗原特异性的免疫耐受可以预防或治疗自身免疫性疾病、器官移植以及基因治疗中潜在的免疫反应。Shi的基因治疗研究团队的研究结果已经证实了血小板特异性αⅡb启动子控制下的凝血因子第Ⅷ因子(2bF8)或第IX因子(2b F9)不仅可以使血友病A或B小鼠模型恢复止血功能,而且可以诱导血友病A或B小鼠模型对第Ⅷ因子(FⅧ)或第FIX因子(FIX)产生抗原特异性的免疫耐受。近年来,大量研究证实了调节性T细胞(T regulatory cell,Treg细胞)能维持免疫系统对自身抗原成分的耐受,在诱导免疫耐受过程中发挥着重要的作用。本课题通过研究2bF8在GFPTreg FⅧ基因敲除小鼠模型(GFPTreg F8null)体内的诱导对FⅧ产生抗原特异性免疫耐受的情况,探讨Treg细胞在2bF8诱导的抗原特异性免疫耐受中的作用;并进一步使用卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)代替FⅧ或FIX来探讨血小板靶向基因转入诱导非凝血蛋白质的抗原特异性免疫耐受的可行性。方法:1、使用本实验室先前报道的已构建的pWPT-2bF8载体并利用钙磷转染法转染293T细胞包装合成慢病毒(2bF8 LV)。同时将第Ⅷ因子基因敲除小鼠(FⅧnull)与Foxp3带GFP绿色荧光融合蛋白的GFPTreg小鼠杂交传代生产出GFPTreg F8null小鼠模型。将2bF8 LV转染经过免疫磁珠分选技术分选出的GFPTreg F8null供者小鼠Sca-1阳性造血干细胞,后移植到经过660 Rad全身照射预处理的GFPTreg F8null受者小鼠体内,即为2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠。2、采用改良FⅧ Chromogenic assay检测2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠血小板的FⅧ:C水平。通过尾尖受伤存活实验及尾尖受伤出血实验检测2bF8LV-GFPTreg F8null小鼠体内的FⅧ的止血功能。3、采用改良Bethesda assay检测2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠在FⅧ免疫前后FⅧ抑制性抗体的产生情况。ELISA法检测小鼠在OVA免疫前后抗OVA Ig G抗体的表达情况。4、流式细胞术检测2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠在FⅧ免疫前后Treg细胞的变化情况,探讨Treg细胞在2bF8诱导抗原特异性免疫耐受中的作用。5、构建pWPT-2b OVA、pWPT-2b Vp OVA及pWPT-2b GFP三种载体并利用钙磷转染法转染293T细胞包装合成慢病毒(2b OVA LV、2b Vp OVA LV及2b GFP LV)。将2b OVA LV、2b Vp OVA LV及2b GFP LV转染经过免疫磁珠分选技术分选出的B6/CD45.2供者小鼠Sca-1阳性造血干细胞,后移植到经过660 Rad全身照射预处理的B6/CD45.1受者小鼠体内。6、流式细胞术检测外周血白细胞表面CD45.1和CD45.2表达情况。采用半定量PCR检测OVA的表达情况。7、采用免疫电镜胶体金标记法定位血小板上的OVA蛋白。用ELISA方法定量检测血小板及血浆中的OVA表达情况,以及血小板激活后释放OVA的量。8、ELISA法检测小鼠在OVA免疫前后抗OVA Ig G抗体的表达情况。结果:1、成功地包装合成2bF8 LV。利用免疫磁珠分选技术分选出GFPTreg F8null供者小鼠Sca-1阳性造血干细胞,纯度接近90%。成功地将2bF8 LV转染Sca-1阳性造血干细胞并移植到经过660 Rad全身照射预处理的GFPTreg F8null受者小鼠体内。2、改良FⅧ Chromogenic assay测得2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠血小板的FⅧ:C水平为5.71±1.17 m U/108 platelets,表达水平介于0.21-30.25 m U/108platelets。尾尖受伤存活实验结果显示2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠尾尖受伤后均能自行止血,全部存活,存活率为100%,而GFPTreg F8null小鼠尾尖受伤后均无法止血,24小时内全部死亡,存活率为0。尾尖受伤出血实验得出:标准化血红蛋白在2bF8 LV-GFPTreg F8null组为61.36±4.97%存留;GFPTreg F8null组为37.88±0.41%;WT组为67.23±4.15%。2bF8 LV-GFPTreg F8null组显著高于GFPTreg F8null组;WT组显著高于GFPTreg F8null组;2bF8 LV-GFPTreg F8null组与WT组比较没有统计学意义。3、改良Bethesda assay得出2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠及GFPTreg F8null小鼠在rh FⅧ输注前均无FⅧ抑制性抗体存在。GFPTreg F8null组小鼠在rh FⅧ输注后产生了FⅧ抑制性抗体,其水平为153±49 BU/ml,介于1.8-600BU/ml,而2bF8 LV-GFPTreg F8null组小鼠经rh FⅧ输注后不产生FⅧ抑制性抗体。ELISA法检测小鼠在OVA免疫前后抗OVA Ig G抗体得出:2b8LV-GFPTreg F8null组小鼠免疫前抗OVA Ig G抗体为250±94;免疫后为366667±33333。GFPTreg F8null组小鼠免疫前抗OVA Ig G抗体为160±80;免疫后为400000±200000。两组免疫后抗OVA Ig G抗体比较无统计学意义,说明2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠对FⅧ产生了抗原特异性的免疫耐受。4、流式细胞术检测小鼠在FⅧ免疫前后脾脏Treg细胞得出:在rh FⅧ输注后,2bF8 LV-GFPTreg F8null组小鼠Foxp3GFP+细胞占CD4+细胞的11.27±0.42%,GFPTreg F8null组为8.37±0.26%,前者显著高于后者(P<0.01)。2bF8LV-GFPTreg F8null组小鼠总Treg细胞数为1.39±0.099(×106),GFPTreg F8null组为0.79±0.04(×106),前者显著高于后者(P<0.01)。并且发现,对于各组小鼠来说,rh FⅧ的免疫输注并不影响Foxp3GFP+细胞占CD4+细胞的百分比及总Treg细胞数。总的来说,无论有无rh FⅧ免疫输注,2b8 LV-GFPTreg F8null组的Foxp3GFP+细胞占CD4+细胞的百分比及总Treg细胞数均显著高于GFPTreg F8null对照组小鼠。5、成功构建pWPT-2b OVA、pWPT-2b Vp OVA及pWPT-2b GFP三种载体并包装合成慢病毒(2b OVA LV、2b Vp OVA LV及2b GFP LV)。利用免疫磁珠分选技术分选出B6/CD45.2供者小鼠Sca-1阳性造血干细胞,纯度接近90%。成功将2b OVA LV、2b Vp OVA LV及2b GFP LV转染Sca-1阳性造血干细胞并移植到经过660 Rad全身照射预处理的B6/CD45.1受者小鼠体内。6、流式细胞术检测小鼠外周血白细胞表面CD45.1和CD45.2表达情况:受者小鼠CD45.2表达的阳性率,在移植后3周为71.22±2.37%,在移植后8周为81.33±1.57%,在移植后12周为88.58±1.41%。受者小鼠CD45.1表达的阳性率,在移植后3周为28.58±2.36%,在移植后8周为18.54±1.55%,在移植后12周为11.30±1.41%。且在各个时间点,CD45.1和CD45.2表达的阳性率在2b OVA组、2b Vp OVA组及2b GFP组三组间比较没有显著性差别。半定量PCR检测OVA的表达情况显示在2b OVA组及2b Vp OVA组均可以看到1158 bp(OVA基因),但无转染的对照组则无1158 bp(OVA)条带。为了证明样本DNA的完整性,我们采用WT m FⅧ(233 bp的PCR产物)作为内参照。7、免疫电镜胶体金标记法定位血小板上的OVA蛋白表达:在2b OVA受者小鼠血小板的α-颗粒内同时检出OVA及鼠内源性VWF蛋白质;而在无转染对照组小鼠血小板的α-颗粒内只检出鼠内源性VWF,未检出OVA。ELISA方法定量检测血小板OVA表达情况得出:2b OVA组为30.35±4.19 ng/108 platelets(n=10),在2b Vp OVA组为2.24±0.48 ng/108 platelets(n=10),而在2b GFP组及无转染对照组均未检测出OVA。检测血浆中OVA表达情况得出:2b OVA组为22.35±4.22 ng/ml(n=5),在2b Vp OVA组为2.59±1.28 ng/ml(n=5),而在无转染对照组未检测出OVA。ELISA方法验证血小板中OVA是否可以被激活从血小板中释放,得出血小板中82%以上的OVA经过血小板激活剂激活后可以被释放。8、ELISA方法检测小鼠在OVA免疫前后抗OVA Ig G抗体的表达情况:实验结果显示外源性OVA免疫后小鼠血浆中抗OVA Ig G抗体在2b OVA组为560±68(n=10),在2b Vp OVA组为320±34(n=10),在2b GFP组为4889±1693(n=9),在无转染对照组为10424±2837(n=24)。2b OVA组及2b Vp OVA组的抗OVA Ig G抗体水平均显著低于2b GFP组(P<0.05),且均显著低于无转染对照组(P<0.05)。2b GFP组的抗体水平与无转染对照组比较无统计学意义。结论:1、血小板特异性αⅡb启动子控制下的凝血因子第Ⅷ因子(2bF8)可以使GFPTreg F8null小鼠模型血小板异位表达FⅧ,并恢复其止血功能。2、2bF8基因治疗可以诱导GFPTreg F8null小鼠模型对FⅧ产生抗原特异性的免疫耐受。3、2bF8 LV-GFPTreg F8null小鼠中Treg细胞的增加在诱导对FⅧ的产生抗原特异性免疫耐受中发挥着重要作用。4、血小板特异性αⅡb启动子控制下的OVA可以使2b OVA及2b Vp OVA受者小鼠血小板异位表达OVA,并大部分储存于血小板的α-颗粒内,并且血小板中82%以上的OVA经过血小板激活剂激活后可以被释放。5、2b OVA及2b Vp OVA均可以诱导2b OVA及2b Vp OVA受者小鼠对OVA产生抗原特异性的免疫耐受。