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目的:本研究旨在观察少阳膝痹方治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎的临床疗效,并基于miR-15a-5p/Akt通路初步探讨少阳膝痹方治疗骨关节炎的作用机制,为“少阳主骨”理论的临床应用提供依据。方法:(1)选择肝肾亏虚型膝骨关节炎患者72例,随机分配至实验组、西乐葆组和仙灵骨葆组,每组24例。各组患者给予相应治疗后评估患者的WOMAC评分、骨关节炎中医证候量化标准积分和少阳证积分,观察各项积分变化情况,并做中医疗效评定。(2)在miRBase数据库、TargetScan基因库筛选出相关的miRNA作为观察指标。将24只SD大鼠按随机数字表法分为A、B、C三组。B、C两组采用Hulth法建模,A组:空白组,大鼠给予生理盐水灌胃。B组:实验组,造模后大鼠予少阳膝痹方灌胃。C组:对照组,造模后大鼠给予生理盐水灌胃。4周后取大鼠膝关节软骨行HE染色,观察病理形态改变。Elisa法测定关节液中IL-1 β及TNF-α含量。RT-PCR检测大鼠膝关节软骨内miR-15a-5p、miR-145-5p 和 miR-29b-3p 相对表达量。(3)临床取三组正常或者不同退变程度的软骨,按损伤程度分为正常组、轻度组和重度组。RT-PCR检测各组软骨内miR-15a-5p和Akt-mRNA的表达。Tunel法检测各组软骨细胞凋亡率。结合检测结果做miR-15a-5p与Akt-mRNA表达量及软骨细胞凋亡率的相关性分析。(4)将pmirGLO质粒用Sac I和Sal I双酶切处理,将含有野生型(WT)和突变型(MUT)Akt mRNA的3’-UTR克隆到酶切后的质粒上,构建双荧光素酶载体pGL3。再将构建的两种pGL3载体分别和miR-15a-5p-mimic或者miR-15a-5p-NC进行转染,用荧光素酶报告基因检测验证 miR-15a-5p 调控 Akt-mRNA 的靶向性。再将 miR-15a-5p-mimics、miR-15a-5p-NC 以及 miR-15a-5p-inhibitors 分别转入 SW1353 细胞内,通过 Western Blot检测Akt,p-Akt,IkB-α,p-IkB-α,p65,p-p65 和 mTOR,p-mTOR 蛋白表达。收集正常SW1353细胞和经过miR-15a-5p-mimic或者miR-15a-5p-NC处理的SW1353细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期。结果:(1)实验组患者经少阳膝痹方治疗后的WOMAC积分低于治疗前,与西乐葆组和仙灵骨葆组比较无明显差异。实验组治疗前后WOMAC积分差值低于西乐葆组,高于仙灵骨葆组。实验组患者经少阳膝痹方治疗后的中医证候量化标准积分明显降低,优于西乐葆组,与仙灵骨葆无明显差异。实验组和仙灵骨葆组中医证候积分差值高于西乐葆组,实验组和仙灵骨葆组之间未见差异。本实验纳入观察的72名患者中65人(90.28%)出现少阳证候,少阳膝痹方可以显著降低患者治疗后少阳证积分,该指标优于西乐葆组和仙灵骨葆组。实验组疗效评定有效率95.65%;西乐葆组有效率78.26%;仙灵骨葆组有效率91.67%。实验组优于西乐葆组,与仙灵骨葆组比较无明显差异。(2)病理结果证实,经过Hulth法造模后大鼠膝关节软骨较空白组均发生了不同程度的退变,实验组中用少阳膝痹方灌胃的大鼠软骨退变程度轻于对照组。实验组大鼠关节液内IL-1 β和TNF-α含量低于对照组并高于空白组。实验组和对照组大鼠软骨内miR-15a-5p,mi R-29b-3p,miR-145a-5p的表达较空白组均出现明显差异,其中miR-15a-5p和miR-29b-3p出现上调,miR-145a-5p出现下调。miR-15a-5p在实验组中的表达要低于对照组。而miR-29b-3p和miR-145a-5p在实验组和对照组中未有差异表达。(3)RT-PCT检测结果显示,miR-15a-5p在骨关节炎软骨内相对表达量升高,重度组的表达量高于轻度组。骨关节炎软骨细胞内的Akt-mRNA的相对表达量降低,其在重度组中的表达量要低于轻度组。重度组骨关节炎软骨细胞凋亡率要高于轻度组,对照组凋亡率最低。相关性分析显示软骨细胞miR-15a-5p相对表达量与Akt mRNA表达呈负相关;软骨细胞miR-15a-5p相对表达量与细胞凋亡率呈正相关。(4)荧光素酶基因报告证实miR-15a-5p可以靶向作用Akt mRNA。Western Blot结果证实高表达的miR-15a-5p可以抑制细胞内Akt通路相关蛋白表达,而少阳膝痹方抑制miR-15a-5p表达后会增加细胞内Akt相关蛋白表达。流式细胞学检测结果显示:转入miR-15a-5p-mimics后细胞凋亡率较正常SW1353细胞增加了6.22倍,多数细胞停留在G1期之前。高表达的miR-15a-5p将细胞阻滞在G0/G1期并诱导细胞凋亡。结论:(1)少阳膝痹方可以有效治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎,对肝肾亏虚型兼有少阳证的患者疗效更为明显。(2)少阳膝痹方可以延缓骨关节炎大鼠软骨退变,减轻软骨炎症反应,抑制软骨细胞内 miR-15a-5p 表达。(3)miR-15a-5p在骨关节炎软骨内呈高表达状态,并与Akt mRNA呈负相关,与细胞凋亡率呈正相关。(4)少阳膝痹方抑制miR-15a-5p表达后可以靶向增加Akt mRNA的表达,并通过Akt通路减少软骨细胞凋亡。