论文部分内容阅读
目的:炎性肠病与多种致病因素有关,如有害的物理或化学制剂、易感基因的多样性、损伤的上皮屏障、肠道微生物的失衡和失调的免疫反应。如今,慢性炎症已经被视为癌症的一个标志。研究表明患有炎性肠病的病人具备更高的风险发展为肠癌,而阻止慢性炎症可能会对癌症的治疗产生深远的积极效果。因此更好地理解发生在炎癌演变过程中的潜在分子变化将有助于识别并阻断炎性肠病进展为恶性肿瘤。Micro RNAs（mi RNAs）通过其种子序列与m RNA靶向结合进而调节基因的转录或翻译,影响基因的表达,进而影响细胞功能,其在生物发育与疾病发生过程中都起着不容忽视的作用。第2～8号碱基序列一致的mi RNAs属于同一个mi RNA家族,其功能大多相似。Mi R-148/152家族由mi R-148a、mi R-148b及mi R-152组成。在先前我们发现mi R-148/152家族成员在肠癌病人的组织中表达下调,同时证实低表达的mi R-148/152家族还与肠癌的恶性表型相关。为了进一步探究mi R-148/152家族在肠癌发生发展中的作用,我们构建了mi R-148/152家族成员敲除小鼠,使用肠炎相关肠癌模型,模拟炎性肠癌的发展过程,明确mi R-148/152家族对肠癌的调控作用,并深入探讨炎癌演变中的分子变化,为肠癌的治疗提供新方向。研究方法:本课题应用硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导急性肠炎,氧化偶氮甲烷（AOM）联合DSS诱导炎性肠癌。首先比较了野生型（WT）小鼠诱导模型前后mi R-148/152家族成员表达差异。接着在mi R-148/152家族成员敲除小鼠中诱导肠炎与炎性肠癌模型,通过比较体重、粪便性状、血便、生存、肠长度、肠癌病灶数量及大小明确mi R-148/152家族成员缺失后对肠炎与肠癌的敏感性影响,并利用HE染色、免疫组化、免疫荧光等实验进一步验证。然后应用TCGA、GEO数据库结合mi R-148/152家族靶基因库,寻找mi R-148/152家族成员影响肠炎与肠癌敏感性的潜在分子机制。应用Real-time PCR、western blotting、免疫组化、荧光素酶报告基因验证靶基因调节关系后,进一步干预靶基因,验证其在mi R-148/152家族成员缺失后对肠炎与肠癌的敏感性影响。结果:1、mi R-148/152家族缺失加重肠炎。首先给予WT小鼠3%的DSS诱导急性肠炎模型,通过Real-time PCR与FISH实验观察到肠炎诱导后小鼠肠黏膜中mi R-148/152家族表达显著下调（p<0.05）。进一步,对mi R-148/152缺失小鼠诱导急性肠炎,通过疾病活动指数评分（DAI score）、小鼠肠长度、HE、PAS、TUNEL染色等发现mi R-148/152缺失小鼠较WT小鼠肠炎更重。2、mi R-148/152家族缺失加重肠炎相关肠癌。进一步我们通过AOM与DSS在WT小鼠诱导肠炎相关肠癌,Real-time PCR与FISH结果表明炎性肠癌WT小鼠较空白组WT小鼠肠黏膜组织中mi R-148/152明显降低（p<0.05）。同样的,在mi R-148/152缺失小鼠诱导肠炎相关肠癌,观察到mi R-148/152缺失小鼠生存更差、肠道癌灶数量及大小显著高于WT小鼠（p<0.05）。免疫组化实验证实,Ki67表达水平在mi R-148/152缺失小鼠肠癌样本中显著高于WT小鼠（p<0.05）。此外,Elisa实验显示mi R-148/152缺失小鼠肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α表达显著高于WT小鼠（p<0.05）。3、mi R-148/152家族通过调控MMP10和MMP13影响肠道屏障功能参与肠炎进展。FITC、免疫组化与免疫荧光实验证实mi R-148/152缺失小鼠在生理情况和肠炎诱导下,肠道屏障功能都显著低于WT小鼠（p<0.05）。通过联立分析肠癌TCGA数据库、AOM/DSS小鼠炎性肠癌GEO芯片数据与mi R-148/152家族靶基因,我们发现MMP10和MMP13可能是潜在的靶基因。Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和荧光素酶实验证实MMP10和MMP13确实为mi R-148/152家族靶基因（p<0.05）。进一步在抑制mi R-148/152的肠癌细胞中沉默MMP10和MMP13的表达,能恢复Zo-1、E-cadherin等紧密连接蛋白的表达,这一结果证实mi R-148/152家族能通过靶向抑制MMP10和MMP13进而影响细胞屏障功能。4、mi R-148/152缺失小鼠发生肠炎时进一步激活NF-κB通路加重肠炎与肠癌进展。NF-κB通路是经典的炎症相关通路,我们通过western blotting和免疫组化实验发现肠炎诱导小鼠中mi R-148/152缺失后,磷酸化p65表达水平显著增加,这证实在mi R-148/152缺失小鼠中NF-κB经典通路显著激活。为了探究mi R-148/152缺失后是如何促进NF-κB经典通路激活,我们应用Targetscan等数据库发现NF-κB经典通路中的IKKα和IKKβ是mi R-148/152家族的靶基因。Real-time PCR、western blotting检测mi R-148/152缺失小鼠以及抑制mi R-148/152的肠癌细胞系发现IKKα和IKKβ表达水平显著增加（p<0.05）,进一步通过荧光素酶实验证实mi R-148/152家族能直接靶向调控IKKα和IKKβ（p<0.05）。5、抑制IKKα和IKKβ能减轻mi R-148/152缺失小鼠肠炎与肠炎相关肠癌。为了进一步证实mi R-148/152缺失小鼠肠炎与肠癌的加重是由于IKKα和IKKβ处于高储备状态引起的NF-κB经典通路过度激活所致,我们应用特异性作用于IκB激酶IKKα和IKKβ的抑制剂IKK16,抑制其磷酸化,观察前后差异。首先我们在诱导急性肠炎与肠炎相关肠癌小鼠中应用western blotting和免疫组化实验检测注射IKK16的实验组与注射葵花籽油的对照组NF-κB经典通路的激活情况。实验证实IKK16能有效抑制IKKα和IKKβ的磷酸化,从而减少IκBα磷酸化,进而抑制p65磷酸化,影响其入核参与转录激活。然后比较体重、测量小鼠肠长度、计算小鼠肠内癌灶数量、HE、增殖相关标志物染色等实验比较注射IKK16的mi R-148/152缺失小鼠相比于对照组mi R-148/152缺失小鼠肠炎症状差异。结果表明通过抑制IKKα和IKKβ的活性干扰NF-κB经典通路,能显著缓解mi R-148/152缺失小鼠肠炎与肠炎相关肠癌的严重程度（p<0.05）。结论:1、Mi R-148/152家族成员缺失加重了肠炎与肠炎相关肠癌。2、mi R-148/152家族成员缺失增加了其靶基因MMP10和MMP13的表达,进而损伤肠上皮细胞间的连接,增加了肠道通透性,使其对肠炎的敏感性增强。3、mi R-148/152家族成员缺失时,靶基因IKKα和IKKβ处于高储备状态,由于本身肠炎易感性,受到急性肠黏膜损伤的刺激,NF-κB经典通路显著激活,一方面维持炎症的发展,另一方面增加癌变的细胞生存能力,从而促使了肠炎相关肠癌的发展。