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革兰阴性菌外膜的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是引起全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distresssyndrome, ARDS)的重要原因,而脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebinding protein, LBP)对LPS的致病性具有重要的调节作用。LPS侵入机体后,首先在LBP介导下,与单核巨噬细胞膜上的LPS受体结合,由膜受体将LPS信号传入细胞内。在细胞质中,组成信号通路的一系列蛋白激酶被依次磷酸化,最终激活转录因子,并由转录因子启动细胞因子和炎性介质的基因表达,进而导致一系列病理过程。有关LBP对LPS调节作用的早期研究显示:LBP可加速LPS与受体CD14的结合而增敏LPS对靶细胞的作用。但最近有人观察到:LBP还可促进LPS与高密度脂蛋白或巨噬细胞膜上清除受体(scavenger receptor, SR)的结合而加速LPS的清除,从而减轻LPS的毒性作用。目前就LBP对LPS不同调节作用的机制仍不清楚。 本研究围绕LBP对LPS的调节作用,从以下三个方面进行了研究:第一,经50%饱和硫酸铵溶液盐析、Bio-Rex70阳离子交换层析和MonoQ阴离子交换层析,从大鼠急性反应期血清中分离、纯化LBP,为进一步研究LBP对LPS的调节机制奠定基础。第二,采用RT-PCR和Western-blotting,观察LPS在诱导肺泡巨噬细胞中TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表达及p38MAPK蛋白激酶活化的过程中,LBP对LPS调节作用的时间和剂量依赖性,从细胞内信号传导和基因转录水平探讨LBP对LPS的调节机制。第三,用油酸和LPS复制一次打击和二次打击的大鼠急性肺损 伤模型,观察LBPmRNA的动态变化及山度若碱的保护作用,探讨LBP 在体内对LPS的增敏效应及山莫蓉碱的保护机制。 研究结果显示:①从300ml大鼠急性反应期血清中分离、纯化到762 u g大鼠 LBP,纯化倍数达 1570倍。纯化的大鼠 LBP在 SDS-PAGE的 60kD 处呈单一条带,并可明显增强 FITC毛PS与外周血单个核细胞(PBMC) 的结合。②当 LPS为 0刀 ling几,LBR为 ling/L以下时,各细胞因子 mRNA 的表达随 LBP浓度的增加而增高,而 10mg/L LBP对各细胞因子 mRNA 表达的上调作用反而有所减弱;当 LPS浓度为 ling几时,不同浓度的 LBP 对LPS诱导肺泡巨噬细胞中细胞因子mRNA的表达无影响。@在各时相 点,LBP对 0乃ling/L的 LPS均有明显的调节作用,而对 ling/L 的 LPS 无调节作用。④LPS刺激15min后,p38MAPK的磷酸化活性开始增高, 30min达峰值,60min后下降。LPS浓度为 0.cling/L时,LBP对 LPS激 活 P38MAPK信号通路有明显的增强和调节作用;LPS浓度为 ling/L时, LBP对LPS激活p38 MAPK无调节作用。⑤用油酸实施一次打击,可使 肺组织中LBP的表达明显增高。在此基础上予小剂量LPS进行二次打击 后,肺组织中 TNF*和 ILJ 0的表达增高;山度若碱干预可抑制 LBP的 上调,减少 TNF·口和 IL刁 0的表达,病理改变也明显减轻。 以上结果表明:①用50%饱和硫酸铰沉淀、Bio.Rex70阳离子交换层 析和MonoQ预装柱的阴离子交换层析,可从大鼠急性反应期血清中纯化 到具有生物学活性的LBP。②LBP对LPS的调节作用具有明显的剂量依 赖性,无时间依赖性。@LBP可影响 LPS对 p38 MAPK信号通路的激活, 这是LBP对LPS发挥调节作用的一个重要机制。④一次打击后LBP的 反应性上调是机体对二次打击敏感性增加的重要原因。山度著碱可通过抑 制LBP的过度表达,阻断LBP对LPS的增敏作用,从而发挥其对内毒素 性肺损伤的防治作用。