转录因子是一种重要的DNA结合蛋白(DNA-binding protein),与染色质调节因子、表观遗传调控子共同作用在细胞基因重编程中发挥着重要作用,调节着细胞增殖、分化、衰老和生死的命运,和细胞再生以及肿瘤形成密切相关。由于转录因子在细胞生命活动中所处的重要位置,所以研究它有着重要的实际意义和价值。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)是一种配体活化的核转录因子,为过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)家族成员之一,其另外两个亚基分别是PPARa和PPARβ/δ。起初研究者认为PPARy只存在于脂肪组织中,参与糖脂能量代谢调节,增强胰岛素敏感性,维持机体稳态。后有研究者发现PPARy在大鼠脾脏以及人巨噬细胞和骨髓前体细胞中也有分布并参与抑制炎症反应。近年来,神经生物学家发现在胚胎脑组织及神经干细胞中PPARy也大量存在并具有促进神经干细胞增殖与分化的功能,更有趣的是,尽管PPARy在成年脑组织中表达量很低,但在中枢神经系统损伤后,其表达量显著升高,这一发现发现提示我们PPARy在神经形成、神经发育及神经损伤后修复中可能起着重要作用。实际上目前已有大量研究表明PPARy在中风、脊髓损伤、神经退行性疾病中具有明显的神经保护作用。关于PPARy神经保护作用机制目前报道的有代谢紊乱纠正机制、抗炎、抗氧化、抗凋亡机制以及促神经再生机制。PPARy通过调节脂连素(adiponectin)、胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor, TNF-α)等因子活性,提高胰岛素敏感性、增加葡萄糖利用率,纠正代谢紊乱；通过抑制核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)等促炎症因子以及胶质细胞活性,减少炎症因子产生；通过抑制NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)氧化酶活性以及促进过氧化氢酶、SOD (superoxide dismutase)等抗氧化酶活性,减少自由基生成；通过激活PI-3K/PDK-1/Akt通路促进Bad磷酸化,维持线粒体跨膜电位稳定,从而最终减轻因代谢紊乱、线粒体功能受损或炎症反应、自由基生成引起的神经元和(或)神经胶质细胞损伤或凋亡。尽管已有研究表明PPARγ激动剂在脊髓损伤模型中能够促进神经前体细胞增殖,但具体调控机制不明。研究者们除了研究PPARγ神经保护作用机制中的调节分子外,还对PPARγ的来源进行了分析。由于神经元内PPARγ较少,所以以往研究常认为是胶质细胞来源的PPARγ发挥的神经保护作用,然而近年来研究发现神经元PPARγ条件性敲除小鼠的脑组织对缺血缺氧的耐受性降低,说明神经元来源的PPARγ同样具有神经保护作用。最近研究发现神经元PPARγ除了具有神经保护作用外还参与神经调节,例如PPARγ通过作用于HPA轴和交感神经系统控制机体对心理应激反应性,下丘脑内PPARγ参与调节摄食和能量平衡等,然而其中的分子机制尚不清楚。基于目前的研究现状,我们一方面致力于探寻神经元PPARγ神经保护作用的新机制,另一方面试图发现PPARγ潜在的新功能。神经保护作用新机制的研究主要集中于找到与PPARγ有着直接关系,促进神经元生长、增殖、分化、突起生长、神经形成的基因,而PPARγ潜在的新功能则主要集中于找到与神经元信息传递关系密切,参与神经调节的基因,以期为神经系统疾病的治疗找到新的治疗靶点。为了找到PPARγ可能调节的基因,我们实验首先利用芯片技术进行高通量筛选。具体做法,取两只成年C57/B6J小鼠,一只腹腔注射12mg/kg体重罗格列酮,另一只腹腔注射相同体积DMSO作为对照,分别作用12h后,取全脑组织；同时另外再取两只脑内PPARγ条件性敲除[转基因小鼠floxp PPARγ (PPARγfl/fl)与Nesin-Cre小鼠交配同窝出生的小鼠]小鼠,一只为对照小鼠,基因型为PPARγfl/flCre-/-,另一只为PPARγ敲除小鼠,基因型为PPARγfl/flCre+/-,不做任何处理,取全脑组织。每只小鼠脑组织一半送于芯片公司用于芯片实验,另一半存留提取RNA(做定量PCR用,以备用来验证芯片结果)。然后利用上海伯豪生物技术有限公司SAS系统对芯片结果进行分析,我们首先选择了如下基因,与细胞生长增殖密切相关的胰岛素受体底物-4(insulin receptor substrate-4, IRS-4),参与神经元信息传递的重要神经递质受体5-羟色按受体2C (serotonin receptor2C,5-HTr2C)和Y-氨基丁酸受体α6(gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-6, GABRA6)。接下来我们在原代培养的大鼠皮层神经元中对PPARγ与IRS-4、ABRA6、5-HTr2C的相关性进行验证。取怀孕17-18天SD胎鼠皮层神经元,培养1周后,用101μM罗格列酮分别处理0h、1h、2h、4h、8h、24h。然后收集细胞提取RNA,利用RT-PCR技术对GABRA6mRNA进行定性分析,利用RT-QPCR技术对IRS-4mRNA、5-HTr2C mRNA进行定量分析。RT-PCR结果发现,罗格列酮处理1h和2h时GABRA6mRNA水平有上升趋势但无统计学差异，至4h和8h时GABRA6mRNA水平下降至基线水平,而处理24h时GABRA6mRNA水平上升为未处理组的2.6倍(P=0.037)。RT-QPCR结果发现,罗格列酮处理4h和24h组IRS-4mRNA分别增高为未处理组的1.47倍(P=0.007)和2倍(P=0.019)。激动剂各小时处理组5-HTr2C mRNA与未处理组相比,无统计学差异。体外实验结果说明,活化PPARγ可能促进GABRA6和IRS-4表达,但还不能排除PPARγ对5-HTr2C没有影响。接下来我们又在体内实验中对PPARy与IRS-4、5-HTr2C之间的关联进行验证,与此同时本实验还引入了另外三个基因一并进行研究,他们分别是突触结合蛋白-2(synaptotagmin2, Syt2)为主要的Ca2+传感器,调节快速神经递质释放；叉头框蛋白C2(forkhead box C2, Foxc2)是重要的转录因子,主要调节与代谢、血管生成／再生及重塑相关基因的表达,其突变与肥胖、先天畸形、肿瘤发生关系密切；基因周期监测点激酶1(checkpoint kinasel, Chekl)为细胞周期检测系统中的重要因子,维持基因组稳定,具有抗凋亡作用,其异常表达与肿瘤形成密切相关。首先取成年雄性C57BL/6J小鼠6-10只,体重22-24g,随机分成两组,对照组(DMSO)和激动剂组(RSG),每组3-5只,激动剂组腹腔注射12mg/kg体重的罗格列酮,作用12h,对照组给予等体积10%DMSO。然后分离皮层、海马,分别提取RNA和蛋白质,用于RT-QPCR实验和免疫印迹实验。RT-QPCR结果发现,与对照组相比,皮层组织激动剂组IRS-4mRNA.5-HTr2C mRNA、Check1mRNA表达分别上升40%、63%、28%(P<0.001,P=0.006, P<0.001), Foxc2mRNA表达下降41%(P<0.001), Syt2mRNA表达量有下降趋势但无统计学差异；海马组织激动剂组Syt2mRNA表达上升51.5%(P=0.002), Foxc2mRNA表达下降51%(P=0.013),其它基因mRNA表达无差异。免疫印迹实验结果发现,皮层组织激动剂组5-HTr2C蛋白水平较对照组上升25.8%,海马组织激动剂组5-HTr2C蛋白水平与对照组相比没有统计学差异。因IRS-4抗体源性的限制,目前市场上用于实验的IRS-4抗体多为人源性或大鼠源的,小鼠源性的几乎没有,所以本实验中没有得到IRS-4在小鼠皮层、海马组织中免疫印迹实验结果的数据。Foxc2、Syt2、Checkl尚在继续验证中,对其蛋白水平还未予以检测。体内实验说明PPARy激动剂促进皮层内IRS-4、5-HTr2C、 Chek1和海马内Syt2表达,而抑制皮层和海马内Foxc2表达。与此同时,为了说明脑内PPARy对备选基因的调控作用,我们利用脑内PPARy条件性敲除小鼠来研究脑内PPARy缺乏对IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、 Check1表达的影响。首先我们从基因型、条件性敲除小鼠特异性包含Cre介导重组体PPARγ (Cre-mediate recombinant PPARy)以及PPARγ mRNA在不同组织中的变化情况这三个方面对转基因小鼠进行基因鉴定分析,然后根据鉴定结果取成年雄性转基因小鼠6-10只,体重22-24g,分成对照组(PPARγfl/fl, fl/fl)和基因敲除组(brain PPARy knockout, BKO)两组,每组各3-5只,fl/fl组基因型为PPARγfl/flCre-/-,BKO组基因型为PPARγfl/flCre+/-。用RT-QPCR技术检测PPARγ对IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Check1在基因水平上的影响,同时用免疫印迹技术检测PPARy对5-HTr2C在蛋白水平上的影响。小鼠基因型检测(PCR)结果可见,fl/fl小鼠在230bp处有特异性条带,100bp处无条带,说明PPARγfl/fl阳性、Cre阴性,基因型为PPARγfl/flCre-/-; BKO小鼠在230bp和100bp处均有条带,说明PPARγfl/fl、Cre均阳性,基因型为PPARγfl/flCre+/-。重组体PPARγ检测(RT-PCR)结果可见,除了BKO小鼠脑组织(皮层、海马)条带在300和400bp处外,其余均在700bp处,说明重组体PPARγ特异性表达在脑组织中。PPARγ mRNA实时定量PCR检测结果可见,BKO小鼠脑组织内(包括皮层和海马)PPARγ mRNA相对表达量明显降低,几乎无法检测到,和PPARγfl/fl(fl/fl)组相比差异显著(P<0.001)；肝组织中PPARγmRNA表达量和PPARγfl/fl(fl/fl)组相比没有差异,肌肉和脾脏组织中PPARγ mRNA表达量和PPARγfl/fl (fl/fl)组相比分别减少0.3倍和增加0.6倍。和脑组织PPARγ变化量相比,脑外组织PPARγ变化量微乎其微,说明脑内PPARγ条件性敲除是成功的。各基因RT-QPCR结果发现,与对照组相比,PPARγ条件性敲除小鼠皮层组织中IRS-4mRNA、5-HTr2C mRNA、Chek1mRNA分别下降14%、45.5%、24%(P=0.04, P<0.001, P=0.037), Foxc2mRNA、Syt2mRNA表达无差异。PPARγ条件性敲除小鼠海马组织中IRS-4mRNA、5-HTr2C mRNA表达水平较对照组无统计学差异,Foxc2mRNA、Chek1mRNA表达分别上升为对照组的3.68倍和1.22倍(P=0.044, P=0.001), Syt2mRNA表达较对照组下降33%(P=0.023)。免疫印迹结果未检测到PPARy条件性敲除小鼠皮层和海马组织中5-HTr2C蛋白水平发生变化。RT-QPCR结果说明PPARγ激动剂促进皮层内IRS-4mRNA、5-HTr2C mRNA、Chek1mRNA和海马内Syt2表达以及抑制海马内Foxc2mRNA表达是脑内PPARy依赖的。为了进一步说明IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Check1受脑内PPARγ调节,我们接下来取成年雄性BKO小鼠6-10只,体重22-24g,随机分成两组,对照组(DMSO)和激动剂组(RSG),每组3-5只,激动剂组腹腔注射12mg/kg体.重的罗格列酮,对照组给予等体积10%DMSO,作用12h后,分离皮层、海马,提取RNA,用于RT-QPCR实验。RT-QPCR结果发现,与对照组相比,皮层组织激动剂组IRS-4mRNA水平上升40%(P=0.016),Foxc2mRNA、Syt2mRNA分别下降32.5%、61%(P=0.013, P<0.001),5-HTr2C mRNA, Checkl mRNA无统计学差异。海马组织激动剂组5-HTr2C mRNA、Foxc2mRNA较对照组分别下降28%和80%(P=0.014,P<0.001),IRS-4mRNA、Syt2mRNA、Check1mRNA无统计学差异。说明PPARγ促进皮层组织5-HTr2C、Checkl和海马组织Syt2表达是PPARγ完全依赖的,而对IRS-4、Foxc2的表达则有可能是和其它通路共同作用调节的。综上所述,GABRA6、IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Checkl表达量受PPARγ影响。PPARγ抑制Foxc2表达,促进皮层组织GABRA6、IRS-4、5-HTr2C、Check1和海马组织Syt2表达,可能具有组织选择性的特点。PPARγ通过PPARγ完全依赖途径促进皮层组织5-HTr2C、Check1和海马组织Syt2表达,而通过PPARγ部分依赖途径影响IRS-4、Foxc2的表达。