骨髓间质干细胞对1-甲基4苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡的保护作用目的近来研究发现，骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)或称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有干细胞特性，有多向分化的潜能，MSCs取材容易，在体外容易培养和增殖，自体MSCs移植又避免了免疫排斥反应。因而骨髓间质干细胞用于中枢神经系统疾病及其损伤修复的细胞学治疗基础，具有广阔的应用前景。帕金森病(Parkinson disease，PD)是一种慢性进展性神经系统变性疾病，主要病理特征是黑质纹状体的多巴胺能(DA)神经元发生退行性变，形态学研究表明PD病人脑内DA能神经元呈凋亡样改变，提示细胞凋亡可能参与了PD的发病过程。1-甲基4-苯基吡啶离子(1-methyl4-phenyl pyridium，MPP~+)能选择性地损害黑质DA能神经元。PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，其所含的受体及递质与黑质DA能神经元相似，能与原代培养的神经细胞说明一致的问题，所以MPP~+制备的PC12细胞模型常作为研究PD的细胞模型。MSCs对DA能神经元的保护作用考虑与其能分泌的细胞因子有关。本实验采用体外培养、纯化MSCs并收集其条件培养液，检测其分泌的对DA能神经元有保护作用的细胞因子(GDNF、BDNF、IL-6)，通过评价MSCs分泌物对MPP~+制备的PC12细胞的c-Jun、bcl2和caspase3的影响，初步探讨MSCs分泌物对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用。方法1、原代骨髓间质干细胞培养液的收集和浓缩2、MSCs细胞表面抗原测定(免疫荧光检测)一抗为CD44及CD45，二抗为CY3。3、MSCs分泌神经营养因子GDNF、BDNF、IL-6蛋白水平测定(ELISA法测定)4、PC12细胞培养和药物处理实验分组为：①空白对照组，在细胞培养体系中不加入任何药物；②MSCs上清液处理组，细胞接种后24h在细胞培养体系中加入MSCs上清液，MSCs上清液30μl、60μl、120μl，并用5％FBS／RPMI1640将终体积补足至300ul，使MSCs上清液体积分数分别为10％、20％、40％。③MPP~+处理组，细胞接种后24h在细胞培养体系中加入MPP~+，终浓度为100μmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1；④联合组，接种后24h在细胞培养体系中加入200μmol／L MPP~+，24h后再分别给予MSCs上清液30，60，120μL。各组细胞给药后24和48h进行下列指标的检测。5、细胞活力测定(MTT法)6、透射电镜观察PC12细胞凋亡7、PI染色流式细胞仪(FCM)检测PC12细胞凋亡8、bcl2、TH、c-Jun、caspase3蛋白的检测(免疫细胞化学法)9、bcl2、c-Jun、caspase3、THmRNA的检测(RT-PCR法)细胞给予MSCs上清液和MPP~+处理后不同时间点用Trizol提取细胞的总RNA，RT反应结束后以cDNA为模板进行PCR扩增。扩增反应结束后每组目的基因各耳义5μL，NADPH取相同体积于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，用凝胶图像分析仪分析，根据目的基因与内参照基因电泳条带密度的比值，进行bcl2、c-Jun、caspase3和THmRNA表达水平的半定量分析。结果1、MSCs可在体外分离扩增，其表面抗原CD44阳性而CD45阴性贴壁细胞呈长梭形，为单个或几个细胞的克隆，细胞形态均一。培养2～5d为生长潜伏期，细胞增殖较慢，细胞数变化不明显。6～12d为细胞快速增殖期，排列有一定方向性，呈旋涡样生长。培养15～18d，细胞出现80％～90％的融合，克隆间出现重叠，无接触抑制现象发生。胰酶消化传代的细胞于12h内完全贴壁、伸展并重新变为长梭形，保持原代细胞形态，生长迅速，7～10d达到完全融合。MSCs表面抗原的鉴定通过免疫荧光检测显示，CD45表达为阴性，证明其为非造血类细胞；CD44表达阳性，证明其为干细胞类细胞(图一A，B，C，D)。2、MSCs培养上清中能分泌神经营养因子GDNF、BDNF、IL-6(表1)3、MTT法MSCs上清液可以抵抗MPP~+对PC12细胞的细胞毒作用，提高细胞生存率MPP~+的终浓度为lOOμmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1孵育24h后，细胞活力与对照组相比(对照组设为1)分别降低至0.76±0.06、0.47±0.02、0.34±0.01；孵育48h后，细胞活力与对照组相比(对照组设为1)分别降低至0.61±0.01、0.30±0.04、0.20±0.04，随着MPP~+浓度的增加，PC12细胞活力逐渐下降，且相邻浓度间比较有显著性差异(P＜0.05)。在相同MPP~+浓度下随着时间的延长，PC12细胞活力逐渐下降，比较有显著性差异(P＜0.05)(图二A，B)。与MPP~+200μmol·L-1孵育24h组相比，联合组(MSCs上清液浓度分别为30μl、60μl、120μ1)，细胞活力由0.47±0.02上升至0.67±0.03、0.77±0.02、0.85±0.01；与48h组相比，联合组细胞活力由0.30±0.04上升至0.50±0.01、0.65±0.05、0.75±0.05(图二C)，比较有显著性差异(P＜0.05)，随着MSCs上清液剂量的增加，PC12细胞活力逐渐增加，且相邻剂量间比较有显著性差异(P＜0.05)(图二C)。4、透射电镜能观察到MPP~+所致PC12细胞凋亡观察到细胞体积缩小和染色质浓缩、边集，核周隙增大，核质比小，细胞膜不完整等细胞凋亡征象(图三B)。5、流式细胞术检测显示MSCs上清液可以降低MPP~+诱导PC12细胞凋亡的凋亡率空白对照组PC12细胞的凋亡率为(1.51±0.11)％，在100μmol·L-1，200μmol·L-1，400μmol·L-1 MPP~+作用PC12细胞24h后，细胞的凋亡率分别增加至(27.76±1.45)％、(42.04±3.21)％、(56.63±4.01)％(P＜0.05)(图四A)。作用48h后，空白对照组PC12细胞的凋亡率为(1.54±0.18)％，MPP~+暴露组细胞的凋亡率分别增加至(43.78±3.29)％、(55.36±3.98)％、(79.35±6.25)％(P＜0.05)(图四B)。200μmol·L-1MPP~+作用PC12细胞24h后，细胞的凋亡率为(42.34±3.21)％，加入30μ1、60μl、120μl MSCs上清液同时处理24h后，PC12细胞的凋亡率分别降为(31.96±2.89)％、(17.89±1.78)％、(10.08±0.91)％(P＜0.05)(图五A)；作用48h后，细胞的凋亡率为(55.36±3.98)％，加入30μl、60μl、120μl MSCs上清液同时处理48h后，PC12细胞的凋亡率分别降为(39.43±3.08)％、(23.13±2.18)％、(14.21±1.41)％(P＜0.05)(图五B)；随着MSCs上清液浓度的增加，PC12细胞的凋亡率依次降低，相邻浓度之间比较有显著差异(P＜0.05)。6、免疫细胞化学法显示MSCs上清液可以增加bcl-2和TH蛋白的表达，降低c-Jun和caspase3蛋白的表达bcl2和TH在200μmol·L-1MPP~+损害后48h，联合组bcl2和TH荧光染色阳性细胞数与MPP~+损害组相比，明显增加(图六和图七)。c-Jun和caspase3在200μmol·L-1MPP~+损害后48h，联合组c-Jun和caspase3荧光染色阳性细胞数与MPP~+组相比，明显减少(图八和图九)。7、RT-PCR法显示MSCs上清液可以增加bcl-2和TH mRNA的表达，减少c-Jun和caspase3mRNA的表达联合组(MSCs上清液浓度分别为30μ1、60μl和120μl)损害后24和48h，bcl-2和THmRNA表达量与GADPHmRNA比值分别升至0.63±0.02、0.71±0.02、0.85±0.01(24h)和0.49±0.01、0.57±0.01、0.67±0.01(48h)及0.55±0.02、0.62±0.01、0.69±0.01(24h)和0.43±0.02、0.52±0.01、0.60±0.01(48h)；联合组的bcl2和THmRNA含量均高于相应时间点的MPP~+组(P＜0.05)；随着MSCs上清液浓度的增加，bcl2和THmRNA表达量依次增加，相邻剂量之间bcl2和THmRNA表达量比较有显著差异(P＜0.01)(图十A，B和图十一A，B)。联合组(MSCs上清液浓度为30μl、60μl和120μl)损害后24和48h，c-Jun和caspase3mRNA表达量与GADPHmRNA比值分别降至0.59±0.01、0.52±0.02、0.43±0.01(24h)和0.68±0.02、0.60±0.01、0.52±0.01(48h)及0.59±0.01、0.53±0.01、0.44±0.03(24h)和0.63±0.01、0.56±0.01、0.50±0.01(48h)：联合组的c-Jun和caspase3mRNA含量与相应时间点的MPP~+组比较明显减低(P＜0.01)；随着MSCs上清液浓度的增加，c-Jun和caspase3mRNA表达量依次降低，相邻剂量之间c-Jun和caspase3mRNA表达量比较有显著差异(P＜0.01)(图十C，D和图十一C，D)。结论研究发现MSCs除了分化为间充质细胞谱系外，还具有向非间充质细胞谱系如神经细胞分化的多向分化潜能。MSCs在体外容易分离培养，并且具有很高扩增能力，使其成为最吸引人、最理想的治疗工具。对MSCs研究中的一项难题是迄今还未发现特异性的MSCs细胞标记物。目前比较公认的相对特异性的MSCs细胞标记物是表达CD90，CD71及CD44抗原，而无CD34，CD45和CD11b等造血干细胞的抗原标志。本实验通过免疫荧光检测细胞表面抗原CD44和CD45，标记为CD44阳性和CD45阴性的细胞即为实验所需的MSCs。MSCs对DA能神经元的保护作用考虑与其能分泌的细胞因子有关，可能是MSCs减少神经元凋亡的机制之一。在生理状态下，MSCs可以分泌NGF、VEGF、GDNF、BDNF、bFGF、HGF、CSF 1等多种生长因子；分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11等细胞因子；这些神经营养因子可能通过不同的机制，起着神经保护作用，减少神经元凋亡。MSCs治疗PD的一个机制是MSCs可以刺激产生多种神经营养因子。本实验用ELISA法检测到MSCs培养上清中能分泌神经营养因子GDNF、BDNF及IL-6。MSCs分泌神经营养因子GDNF、BDNF及IL-6对MPP~+损坏的DA能神经元发挥神经保护作用。尤其GDNF是公认的能促进中脑DA细胞存活的神经营养因子。GDNF对发育及成熟的DA能神经元有保护、修复作用，可增强体外培养的DA能神经元对DA的摄取，促进DA能神经元的分化。BDNF对培养的胚胎基底前脑胆碱能神经元、黑质DA能神经元和氨基丁酸能神经元均有营养作用。IL-6作用于DA(儿茶酚胺)能神经元，酪氨酸羟化酶活性增强，神经元生存期延长，细胞内DA增多。本研究MTT法揭示了与MPP~+暴露组相比，联合组细胞活力明显提高。表明MSCs上清液可以有效保护MPP~+对PC12细胞的毒性损伤，并且浓度越高MSCs上清液的保护作用越好。PI染色FCM检测发现与MPP~+暴露组相比，联合组细胞的凋亡率明显降低，提示MSCs上清液可明显减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；随着MSCs上清液浓度的增加，其减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡作用在增加。帕金森病是一种慢性进展性神经系统疾病，帕金森病的发病机制一直是人们研究和关注的热点，近年来随着神经生物化学和组织化学研究技术的进步，发现细胞凋亡与帕金森病发生存在重要联系。黑质DA能神经元凋亡的细胞内部调控是一个极其复杂的过程，ROS、bcl2、bax、caspases3均充当了重要的角色，其核心环节可能是内外环境的毒素破坏了钙离子平衡，造成钙超载，导致呼吸链产生自由基增多，降低bcl2，并激活caspases3来共同参与细胞凋亡的调控，最终引起DA能神经元的凋亡。本研究免疫细胞化学法bcl2蛋白检测结果提示联合组bcl2荧光染色阳性细胞数与相应时点MPP~+损害组相比，明显增加，提示MSCs上清液可通过增加抗凋亡因子bcl2蛋白含量，减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；RT-PCR法bcl2mRNA的检测结果提示联合组的bcl2mRNA含量均高于相应时间点的MPP~+组，提示MSCs上清液可明显增加抗凋亡因子bcl2mRNA含量，从而减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；随着MSCs上清液浓度的增加，bcl2mRNA表达量依次增加。以上结果从mRNA水平提示，随着MSCs上清液浓度的增加，其减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡作用在增加。bcl2蛋白是一种膜整合蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜上。研究表明，bcl2蛋白对黑质DA能神经元的保护作用可以通过抗氧化作用来实现。我们的研究显示，MSCs可以改善MPP~+损害所致的bcl2mRNA和蛋白水平的下调，从而发挥神经保护作用。本研究免疫细胞化学法c-Jun和caspase3蛋白检测结果提示相对于MPP~+组，联合组的荧光染色阳性细胞数明显减少。提示MSCs上清液可通过降低促凋亡因子c-Jun和caspase3蛋白含量，减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；RT-PCR法c-Jun和caspase3mRNA的检测结果提示联合组的c-Jun和caspase3mRNA含量均低于相应时间点的MPP~+组，提示MSCs上清液可明显降低促凋亡因子c-Jun和caspase3mRNA含量，从而减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡诱导作用；随着MSCs上清液浓度的增加，C-Jun和caspase3mRNA表达量依次降低。以上结果从mRNA水平提示，随着MSCs上清液浓度的增加，其减轻MPP~+对PC12细胞的凋亡作用在增加。caspase是细胞凋亡的效应器，特别是caspase3被认为是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路。中脑黑质DA能神经元的丢失是PD的主要病理特点。用免疫组化方法测定PD患者死亡后脑组织时发现，中脑DA能神经元的丢失与caspase3阳性神经元呈正相关。我们的研究显示MSCs通过阻断caspases3的活化来抑制细胞凋亡的进程。已确定的凋亡前信号分子JNK(c-JunN末端激酶)与神经退变性疾病相关。JNK信号级联可能是MPTP诱导神经元死亡的机制之一。JNK可使与谷胱甘肽转移酶结合的谷胱甘肽-c-Jun聚合蛋白氨基末端磷酸化，从而启动c-Jun介导的细胞凋亡信号转导系统。MSCs对DA神经元的这种保护作用可能与其抑制JNK活性，减少c-Jun磷酸化作用有关。MSCs可在体外迅速扩增；其表面抗原CD44阳性而CD45阴性；MPP~+能诱导PC12细胞凋亡；MSCs能分泌GDNF、BDNF、IL6等多种对退变DA能神经元有保护作用的神经营养因子，因此MSCs对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡有保护作用，这种保护作用的强弱与其上清液浓度有关，其作用机制是通过增加抗凋亡因子bcl2和抑制促凋亡因子c-Jun和caspase3等多种渠道来实现的。本研究为MSCs治疗帕金森病提供了一定的实验基础。