orf60基因对家蚕杆状病毒复制和转录的调控作用

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众所周知,家蚕杆状病毒(BmNPV)多角体启动子具有超高效的启动功能,在昆虫杆状病毒表达系统中常被用来启动外源基因的表达。通过酵母单杂交技术筛选出多种与多角体启动子存在相互作用的蛋白因子,其中ORF60蛋白被认为是BmNPV的DNA结合蛋白,且可能具有调控病毒基因转录的功能,但其调控机制还不是很清楚。  本研究构建了orf60缺失型病毒orf60-ko-Bacmid。Bac-to-Bac技术将敲除的片段再次补回到家蚕杆状病毒(BmNPV)基因组中,通过此技术,我们又成功的构建了orf60补回型病毒orf60-re-Bacmid。然后将三种病毒(wtBacmid、orf60-ko-Bacmid和orf60-re-Bacmid)分别转染家蚕BmN细胞,病毒滴度和荧光定量PCR(qPCR)实验结果表明,orf60是BmNPV基因组复制的必需基因,也是包装成成熟病毒的必需基因。反转录实时定量PCR(RT-qPCR)分析orf60基因的转录时相,结果表明orf60基因是BmNPV的一个晚期基因。进一步通过qPCR技术分析orf60基因缺失对野生型病毒(wtBmNPV)3个不同时期(早期、晚期和极晚期)基因转录的调控作用,结果表明orf60基因的缺失导致病毒各个时期基因的转录水平均显著降低。最后,构建了一个由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动的海肾萤光素酶构成的双萤光素酶检测系统,实验结果表明orf60基因在BmNPV多角体启动子启动转录的过程中起正调控作用。
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