背景目前,发达国家男性最常见的癌症是前列腺癌,前列腺癌是全世界男性恶性肿瘤相关死亡的主要原因。我国近些年来,由于人们生活方式、饮食习惯的改变和人口老龄化等原因,前列腺癌的发病率逐年上升。由于前列腺癌无特异性早期症状及肿瘤筛查相对滞后等原因,我国很多前列腺癌患者在明确诊断时往往已是肿瘤晚期。目前临床上主要应用前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)及前列腺穿刺活检(prostate biopsy)的病理学对前列腺癌诊断、监测进展及预后判断。Gleason评分是前列腺腺癌组织学分级的方法,被广泛用于诊断、评估患者预后及指导治疗方案的选择。但是目前这些用于诊断及预后判断方法的准确率和有效性仍不很高,需要新的和更特异性的生物标志物用于临床。局限性前列腺癌的标准治疗包括根治性手术和根治性放疗,虽然早期前列腺癌通常可以治愈,但在发现时往往有20%～30%患者的肿瘤已侵犯到前列腺外,对于该类患者,目前临床上常用放疗及雄激素去势治疗(Androgen-deprivation therapy, ADT)改善患者总生存期,尽管大多数患者起初对内分泌治疗有效,但经过中位时间14～30个月后,几乎所有患者都将逐渐由雄激素敏感性前列腺癌转变成去势抵抗性前列腺癌(Castrate-resistant Prostate Cancer, CRPC)前列腺癌一旦进展到CRPC,尤其是转移性CRPC (metastatic CRPC, mCRPC)则预后极差,CRPC是前列腺癌患者死亡的主要原因。尽管近几年新开发的一些抗肿瘤药物,如多西他赛、醋酸阿比特龙、卡巴他赛、恩扎鲁胺和sipuleucel-T等,在一些CRPC患者中显示出一定临床疗效。然而,对患者总生存率改善不尽人意。因此,迫切需要了解前列腺癌发生发展的潜在分子机制,以帮助发现可用于早期诊断、预后判断的生物标记物,以及发现更有效的治疗方法。小分子核糖核酸MicroRNAs(简写成miRNAs)是广泛存在于多细胞有机体如植物、动物及人类中的一类内源性非蛋白质编码的RNA小分子(包含约22个核苷酸),miRNAs通过序列互补识别并结合靶基因信使RNA(mRNA),促使靶基因mRNA的降解或翻译抑制,参与转录后基因表达的调控。miRNAs调节多种细胞功能,包括调节细胞生长、细胞和组织分化(与癌症发生相关的细胞过程)、凋亡以及抗应激等。目前,在所有物种中已确认超过10,000个miRNAs,人类基因中已发现超过1300个miRNAs。人类miRNAs多数位于基因间区或已知的转录内含子内,大约有1%-5%的基因是miRNAs,它们参与调节大约60%的蛋白质编码基因。即使一个单一的miRNAs异常表达,也可能会影响到大量的细胞过程,据预测每个miRNAs有可能影响到上百个蛋白质的表达,从而破坏体内平衡状态。有趣的是,一个基因编码序列可由几个miRNAs调控,而一个miRNAs可调控多个靶基因mRNA。越来越多的证据表明,miRNAs表达失调和功能的改变与人类肿瘤不受控制的生长有关,它们参与调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡等生物过程。在人类许多恶性肿瘤中,都观察到存在miRNAs表达失调。同样在前列腺癌细胞,也发现一些miRNAs较前列腺良性组织发生了改变,例如miR-16、miR-23b、miR-143、 miR-145、let-7、miR-99、miR-125、miR-221、miR-29和miR-30等在前列腺癌表达下调,而miR-21、miR-20a、miR-32、miR-184、miR-198和miR-370等则在前列腺癌表达上调。抑癌miRNAs缺少或致癌miRNAs的表达增加最终促进肿瘤细胞增殖、浸润和转移。研究发现,作为miRNAs之一的miR-556同样参与了肿瘤的发生发展,2006年在关于人结直肠癌细胞miRNAs表达谱的研究中首次描述了miR-556,其后的第二年,Landgraf等在对恶性肿瘤miRNAs分析中miR-556作为致癌miRNAs被描述,随后在其他恶性肿瘤如宫颈癌和黑色素瘤等亦描述了miR-556。目前对于很多miRNAs,尤其是miR-556在前列腺癌中的作用尚不清楚,更加全面深入的研究这些miRNAs及其调控的基因,对进一步了解前列腺癌发生发展机制,发现新的早期诊断及预后判断的肿瘤标记物,以及开发新的靶向治疗药物具有重要意义。目的前列腺癌进展到CRCP后预后很差,目前尚无有效的治疗方法,急需发现能够早期诊断及判断预后的生物标志物,以及新的治疗靶点。目前,microRNAs与前列腺癌发生发展的相关性尚不清楚,需要进一步研究以更好地了解miRNAs在前列腺癌的基因调控网络。本课题通过检测作为miRNAs之一的miR-556-5p在前列腺癌的表达及对肿瘤细胞生物学行为的影响,旨在研究miR-556-5p在前列腺癌发生发展中的作用,通过进一步探讨miR-556-5p的作用机制,从而有望为前列腺癌早期诊断、预后判断提供新的生物标记物,并提供潜在的治疗靶点和治疗策略。方法为研究miR-556-5p在前列腺癌发生发展中的作用及机制,本课题分三部分进行。第一部分：为了检测miR-556-5p在前列腺癌的表达情况,我们在临床收集前列腺癌组织和对应的癌旁非肿瘤组织,并培养人类前列腺癌细胞系M12、 Tsu-Prl、PC3、DU145、22RV1和LNCAP以及非肿瘤前列腺上皮细胞系RWPE-1,应用实时定量PCR技术检测miR-556-5p表达水平,分析miR-556-5p在临床前列腺肿瘤组织及前列腺癌细胞系中的表达有无失调。第二部分：为了研究miR-556-5p在前列腺癌细胞中的作用,我们通过上调和下调前列腺癌PC3细胞miR-556-5p的水平,应用MTT测定、细胞集落形成实验和锚定非依赖性生长测定等方法,观察miR-556-5p对PC3细胞生物学行为的影响。第三部分：为进一步探讨miR-556-5p在前列腺癌中的作用机制,我们应用生物信息学算法预测miR-556-5p可能的靶基因,然后通过蛋白印迹技术(western blotting)和荧光素酶检测法(luciferase assay)验证,其后进一步研究靶基因在前列腺癌中的作用。结果miR-556-5p在前列腺癌组织和前列腺癌细胞系中表达上调。与相邻非肿瘤组织和非肿瘤上皮前列腺细胞系相比,在8例前列腺癌患者标本及6个前列腺癌细胞系中,miR-556-5p均明显高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-556-5p促进前列腺癌细胞增殖。miR-556-5p表达失调增加了PC3细胞的生长率,细胞集落形成实验显示miR-556-5p的上调促进了PC3细胞的集落形成能力,锚定非依赖性生长测定显示PC3细胞的独立生长能力和miR-556-5p水平相关(P<0.05),而下调miR-556-5p则显示出相反的作用(P<0.05)。PPP2R2A是miR-556-5p直接调控的下游靶基因。我们用TargetScan算法发现PPP2R2A mRNA 3’-非编码区(3’-UTR)与miR-556-5p“种子”序列互补。为证实miR-556-5p是否通过直接结合3’-UTR区域抑制PPP2R2A的表达,我们应用蛋白印迹技术和荧光素酶检测法,野生型PPP2R2A的3’-UTR克隆进荧光素酶基因,荧光素酶基因转染PC3细胞,PC3细胞同时分别被miR-556-5p mimics、 miR-556-5p inhibitor及miRNA negative controls (NC)共转染。蛋白印迹结果显示上调miR-556-5p的PC3细胞的PPP2R2A蛋白水平显著降低(P<0.05),而下调miR-556-5p则促进PPP2R2A蛋白的表达。上调PC3细胞miR-556-5p后,PPP2R2A 3’-UTR荧光素酶的活性显著降低(P<0.05),而下调miR-556-5p则出现相反的结果(P<0.05)。此外,与miRNA NC共转染细胞相比,突变型miR-556-5p共转染细胞的荧光素酶活性无明显改变(P>0.05)。这些研究结果表明miR-556-5p通过直接结合到PPP2R2A 3’-UTR对PPP2R2A进行负调控。本课题通过进一步研究miR-556-5p对PPP2R2A下游基因p27、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的影响发现,在上调miR-556-5p表达的PC3细胞中p27 mRNA及蛋白表达均下调,而cyclin D1则表达上调。反之,在下调miR-556-5p的PC3细胞中,p27 mRNA及蛋白表达上调,而cyclin D1表达下调。结果表明PPP2R2A下游基因p27、cyclin D1参与了miR-556-5p对前列腺癌PC3细胞增殖的调控过程。本课题在下调miR-556-5p的PC3细胞,下调PPP2R2A的表达,观察PPP2R2A下调后对肿瘤细胞集落形成能力和锚定非依赖性生长能力的影响,结果显示下调PPP2R2A可以逆转因miR-556-5p下调所致的PC3细胞增殖抑制作用,即在miR-556-5p促进前列腺癌PC3细胞增殖的过程中,PPP2R2A下调是必须的。结论我们的研究显示miR-556-5p在临床前列腺癌组织和前列腺癌细胞系中表达上调,miR-556-5p这种表达失调导致PPP2R2A表达下调,使p27表达下调及周期蛋白D1表达上调,从而最终促进前列腺癌细胞增殖。总之,我们的研究表明,miR-556-5p作为前列腺的一种致癌miRNAs,通过抑制PPP2R2A表达,在前列腺癌的发生和发展中起重要作用。意义本研究表明miR-556-5p在前列腺癌中表达上调,是一种致癌miRNAs,而且首次发现PPP2R2A是miR-556-5p的直接调控靶基因,miR-556-5p通过负性调控PPP2R2A,促进前列腺癌细胞增殖。因此,本研究将有助于更好地了解前列腺癌的发病机制,miR-556-5p有可能作为前列腺癌的一个早期诊断、预后判断的生物标记物,以及新的治疗靶点。miR-556-5p最令人兴奋的临床应用前景是可能有助于前列腺癌患者的精准治疗。