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背景:作为眼外伤的一种严重的并发症,增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)是视网膜复位术后失明的主要原因,其主要特征是眼外伤后视网膜色素上皮细胞过度的增殖,迁移和收缩。PVR的形成机制很复杂,目前对其理解仍然不够透彻。在PVR中,蛋白表达谱发生了明显变化,蛋白质组学作为一种鉴定和定量技术可为包括PVR在内的多种疾病的早期诊断和临床治疗提供分子标志和作用靶点,基于此我们可将差异表达的蛋白进行深入研究。目的:首先,对外伤性PVR患者的视网膜和正常人眼的视网膜进行蛋白质组学分析,以找出两种状态下视网膜组织中存在的差异表达蛋白,力求为外伤性PVR的发病机制提供新的依据,并为PVR的预防和治疗寻找新的突破口。接着,在人视网膜色素上皮细胞(Human retinal pigment epithelial,RPE)系ARPE-19细胞中敲降人视网膜特异性ATP结合盒转运体(ABCA4)的表达,研究其对RPE细胞活力、增殖、凋亡和迁移能力的影响,为外伤性PVR的防治提供新思路。方法:在蛋白质组学分析中,(1)获取实验组和对照组视网膜标本,并用BCA法对其蛋白浓度定量;(2)运用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色对蛋白质的提取进行评估;(3)对提取蛋白质进行高效液相色谱-质谱(high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry,HPLC-Chip MS/MS system)分析;(4)采用Label-free对样品进行定性定量分析;(5)对鉴定的差异蛋白质进行生物信息学分析:GO富集分析,KEGG通路分析,层次聚类分析;(6)运用RT-qPCR和Western blot对鉴定出的显著上调的差异蛋白ABCA4进行表达验证。在研究ABCA4作用机制的实验中:(1)我们在RPE细胞系ARPE-19中转染特异性靶向ABCA4的小干扰RNA,siABCA4或非特异性的对照siRNA,siNC。利用qRT-PCR和western blot测定ABCA4的表达水平。(2)在ABCA4敲降的RPE细胞或对照细胞中利用MTT比色法检测细胞活力随培养时间变化。(3)利用流式细胞术结合Annexin V-FITC或PI染色比较两组细胞周期和凋亡变化。(4)采用划痕实验检测ABCA4敲降和非敲降细胞迁移能力的大小。(5)此外,采用western blot法检测两组细胞细胞增殖、周期和凋亡相关蛋白的表达水平。结果:在蛋白质组学研究中我们发现:(1)外伤性PVR患者视网膜蛋白质浓度为19.7 ug/ul,此数值略高于正常人视网膜中的蛋白质浓度(14.1μg/ul);(2)本实验中蛋白提取的效果良好,且与正常捐献者视网膜蛋白表达相比,外伤性PVR患者的视网膜中蛋白浓度较高,表现为高丰度蛋白质所占的比例较大。(3)LC-MS/MS分析共分离和鉴定到捐献眼和外伤性PVR视网膜中肽段数25305个,蛋白质组数3541个。(4)Label-free分析共鉴定出3518个蛋白质,其中241个为差异表达蛋白。(5)GO富集分析的结果表明,所鉴定的差异蛋白质共涉及了 18个生物学过程,15个分子功能和9个细胞组分。其中包含差异蛋白数目最多的前五个生物学过程依次是:多细胞生物过程,单-多细胞生物过程,细胞周边反应,质膜,外部刺激响应。(6)KEGG分析的结果表明,所鉴定蛋白质参与最多的前5个通路依次是:亨丁顿舞蹈症,氧化磷酸化,焦点黏连,阿尔兹海默症,非酒精性脂肪肝。(7)层次聚类分析的结果表明,在241个差异蛋白中,上调表达蛋白共88个,下调表达蛋白共153个。(8)RT-qPCR和western blot检测的结果表明,ABCA4在外伤性PVR中表达显著上调。ABCA4的功能研究结果发现:(1)通过转染ABCA4特异性的siRNA,siABCA4成功在RPE细胞系ARPE-19中抑制了 ABCA4的表达,构建了 ABCA4低表达的ARPE-19细胞。与转染对照非特异性的siRNA相比,转染了 siABCA4的细胞,细胞活力随培养时间的增加显著受到了抑制。Western blot测定增殖细胞相关抗原不溶性增殖细胞核抗原(Proliferating cel l nuclear antigen,PCNA)和 Ki67 的结果表明:转染 siABCA4 的细胞PCNA和Ki67表达量显著降低,表明正常增殖细胞数目的减少。(2)PI染色结合流式细胞术对两种细胞的细胞周期研究结果显示:与转染对照siRNA的细胞相比,转染siABCA4的细胞,处于G0/G1期的细胞所占比例明显上调,而处于S期和G2/M的细胞所占比例明显降低,表明转染siABCA4降低ABCA4的表达引起RPE细胞系ARPE-19细胞周期G0/G1期停滞。分子机制研究发现p21,也被称为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(cyclin-dependent kinase inhibitor 1,CDKN1)或 CDK 1 相互作用蛋白 1(CDK-interacting protein 1,CDK 1)在ABCA4低表达的ARPE-19细胞中蛋白表达明显提高;而两种促进细胞周期进展的细胞周期调控蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin-dependent kinase 4,CDK4)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达显著降低。(3)Annexin V-FITC染色结合流式细胞术对两种细胞的细胞凋亡的研究发现,与转染对照非特异性siRNA的细胞相比,转染siABCA4的细胞,早期和晚期凋亡细胞比例均明显提高。分子机制研究发现,与ABCA4正常表达的细胞相比,促细胞凋亡蛋白Bax和Bad在ABCA4低表达的ARPE-19细胞中蛋白表达明显提高。(4)划痕实验的研究结果表明,与转染非特异性对照siRNA相比,转染特异性siABCA4降低ABCA4表达的RPE细胞迁移能力显著降低。结论:(1)外伤性PVR患者与正常人视网膜中共存在241种差异表达蛋白,包括88个上调蛋白和153个下调蛋白。(2)ABCA4在外伤性PVR视网膜中显著上调,表明其可能在PVR发生发展中起着关键作用。(3)在RPE细胞系ARPE-19细胞中转染特异性靶向ABCA4的小干扰RNA,siABCA4可以降低ABCA4的表达,构建ABCA4低表达的ARPE-19细胞。(4)在RPE细胞中使用siABCA4降低ABCA4的表达可抑制细胞活力随培养时间增加,细胞增殖并诱导其发生细胞凋亡。(5)siABCA4对RPE细胞活力,增殖和凋亡的作用可能与细胞周期调节蛋白p21,CDK4和Cyclin D1的异常表达以及促细胞凋亡蛋白Bax和Bad表达增加相关。(6)在RPE细胞中使用siABCA4抑制ABCA4的表达可降低RPE细胞迁移能力。(7)ABCA4有潜力成为外伤性PVR防治的靶点。