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研究背景:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种较为复杂的自身免疫性结缔组织病,其临床表现多样且具有异质性,受累部位极为广泛,可累及包括皮肤、关节、肾脏、心血管系统、血液系统和中枢神经系统在内的几乎全身各个器官和组织,甚至可危及患者的生命。SLE的发病机制尚不明确,但大量的研究表明其发病与遗传、环境、激素等因素有关,其中遗传易感性是主要危险因素之一。此外,SLE较高的致残和致死率仍令人担忧,尽管随着糖皮质激素、环磷酰胺、抗疟药等传统药物和以生物制剂为代表的靶向治疗的发展,其预后已得到显著的改善,但这些药物仅对部分患者有效,且存在副作用。因此,探索SLE的发病机制从而为寻找新的SLE治疗方法提供理论基础显得尤为重要。我们团队前期利用全基因组关联分析研究（genome-wide association study,GWAS）和全外显子组测序研究对SLE进行了大量的遗传学研究,鉴定了 SLE的全新易感基因——双孔通道蛋白 2（two-pore segment channel 2,TPC2,也称 TPCN2）和长链非编码RNALINC01420。然而,其在SLE发病机制中的作用尚不清楚。研究目的:本研究通过以下两个部分来阐述新发现的遗传变异（TPCN2和长链非编码RNA LINC01420）在SLE发病中的作用并初步探索其分子机制:第一部分:TPCN2基因缺陷在系统性红斑狼疮发病机制中的作用;第二部分:长链非编码RNA LINC01420在系统性红斑狼疮发病机制中的作用。第一部分:TPCN2基因缺陷在系统性红斑狼疮发病机制中的作用研究方法:1.收集6名SLE患者和与之年龄、性别匹配的7名健康对照者（healthy control,HC）的外周静脉血,通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）分别检测SLE患者和HC的PBMC中TPCN2的表达水平;2.通过慢病毒感染的方法构建稳定敲低TPCN2的细胞株,并通过qPCR和Western Blot分别从信使RNA（messenger RNA,mRNA）和蛋白质水平验证敲低效果,用于后续实验;3.通过CCK-8（cell counting kit-8）法检测敲低TPCN2对细胞增殖影响;4.通过流式细胞术检测敲低TPCN2对细胞凋亡和细胞周期的影响;5.通过RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）及后续通路富集分析评估敲低TPCN2影响SLE发生发展可能的分子机制,并采用qPCR检测关键差异基因的表达,从而验证RNA-seq的准确性。结果:1.与HC相比,TPCN2在SLE患者的PBMC中表达显著降低（p＜0.05）;2.与对照组相比,TPCN2在敲低组（shTPCN2#1和shTPCN2#2）中的mRNA和蛋白水平表达均显著下降（p＜0.05）,成功构建了敲低TPCN2的细胞株;3.CCK-8结果显示敲低TPCN2能显著抑制Jurkat和THP-1细胞的生长（p＜0.05）;4.流式细胞术表明敲低TPCN2促进细胞凋亡和G2/M期阻滞（p＜0.05）;5.RNA-seq结果显示,共筛选出2178个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中上调基因1268个,下调基因910个,进一步在Jurkat和THP-1细胞中通过qPCR法验证关键差异基因的表达,其与测序结果趋势一致;京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）和基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）分析表明TPCN2主要通过影响叉头转录因子（FOXO）、T细胞受体、G2/M检查点、白介素6-两面神激酶-信号传导转录激活因子 3（interleukin 6-janus kinase-signal transducer and activator of transcription 3,IL6-JAK-STAT3）、磷脂酰肌醇激酶-苏氨酸激酶-雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide 3 kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin,PI3K-AKT-mTOR）等途径,从而调控细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期等细胞生物学过程。结论:SLE患者PBMC中TPCN2表达显著下降,TPCN2基因缺陷能显著抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和G2/M期阻滞,TPCN2可能是SLE潜在的保护因子。第二部分:长链非编码RNA LINC01420在系统性红斑狼疮发病机制中的作用研究方法:1.收集40名SLE患者和与之年龄、性别匹配的52名HC的外周静脉血,采用密度梯度离心法分离PBMC,进一步通过qPCR法检测SLE患者和HC的PBMC中长链非编码RNALINC01420的表达水平;2.通过荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,FISH）和 qPCR 等方法检测LINC01420在THP-1细胞中的亚细胞定位;3.用 100ng/ml 的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）干预 THP-1 细胞不同时间（0、1、2、4、8和12小时）,通过qPCR法检测LINC01420在LPS诱导的炎症反应过程中的表达变化;4.通过慢病毒感染的方法构建稳定过表达/低表达LINC01420的THP-1细胞,并通过qPCR技术验证其干扰效果,用于后续实验;5.用100ng/ml的LPS分别处理过表达/低表达LINC01420的THP-1细胞2小时,分别采用 qPCR 和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A）技术检测炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,TNF-α）、IL-6和白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）在mRNA和蛋白质水平的表达;6.通过CCK-8法检测LINC01420对THP-1细胞增殖的影响;7.用核因子κB（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）抑制剂（PDTC）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）抑制剂（U0126）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）抑制剂（SP600125）和 p38 抑制剂（SB203580）预处理THP-1细胞,然后100ng/ml的LPS刺激2小时,通过qPCR法检测LINC01420的表达变化,以确定LINC01420响应于LPS诱导的炎症反应过程的主要通路;8.分别用LPS干预过表达/低表达LINC01420的THP-1细胞不同的时间（0、30、60 和 120 分钟）,通过 Western Blot 检测 p-ERK、p-p38、ERK 和 p38 的变化。结果:1.与HC相比,LINC01420在SLE患者PBMC中呈低表达（p＜0.05）;2.FISH结果表明LINC01420主要表达于THP-1的细胞核中;qPCR结果与FISH相似,与细胞质相比,THP-1细胞核中LINC01420的mRNA水平显著增加（p＜0.05）;3.LPS诱导LINC01420在THP-1中表达显著下降（p＜0.05）,尤其刺激2小时的时候达到峰值;4.经慢病毒感染后,在目的细胞中均可观察到绿色荧光,表明感染成功;此外,与对照组（Control或OE-Control）相比,低表达组（shLINC01420#1 和shLINC01420#2）中LINC01420的表达显著下降（p＜0.05）,而过表达组（OE-LINC01420）中LINC01420的表达显著上调（p＜0.05）,成功构建过表达和低表达LINC01420的THP-1细胞株;5.给予LPS刺激,qPCR和ELISA结果均显示低表达LINC01420的细胞株中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平增加,而过表达LINC01420的细胞株则呈相反趋势;6.CCK8结果显示LINC01420对THP-1细胞的生长几乎没有影响;7.qPCR结果显示,预处理p38抑制剂（SB203580）和ERK抑制剂（U0126）可增加LPS诱导的LINC01420下降（p＜0.05）,而NF-κB和JNK抑制剂（PDTC和SP600125）对其影响无统计学差异;8.Western Blot结果显示,与对照组相比,敲低LINC01420后,LPS可诱导丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）通路的磷酸化,尤其是p-ERK、p-p38显著上调,而过表达LINC01420则呈相反趋势。结论:SLE患者PBMC中长链非编码RNA LINC01420显著下调,其主要定位于THP-1的细胞核中,敲低LINC01420可通过激活p-p38、p-ERK显著促进细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,而不影响细胞增殖,相反,过表达LINC01420可显著抑制细胞炎症因子的表达,因此,长链非编码RNA LINC01420可通过MAPK通路发挥抗炎作用,成为SLE潜在的保护因子。以上两部分实验结果,我们总结如下:1.TPCN2通过调节细胞凋亡和细胞周期而成为SLE潜在的保护因子;2.长链非编码RNA LINC01420通过MAPK通路发挥抗炎作用而成为SLE潜在的保护因子。本研究阐明了两个全新发现的遗传变异易感基因TPCN2和长链非编码RNA LINC01420在SLE发生发展中的作用机制,为解析SLE发病机制提供了新的实验证据,并为探索潜在的SLE治疗方法提供了新方向。