细胞微环境对细胞形态、功能发育及组织修复等具有极其关键的作用,而肿瘤的发生、发展和转移等进程与其微环境的相互作用已成为当前癌症及肿瘤领域的研究热点。传统体外二维培养条件难以重现肿瘤微环境条件,其固有缺陷无法有效对应肿瘤细胞在体环境中的细胞生长维度、细胞间相互作用、生化因子群、胞外基质(ECM)理化特性、应力刺激等因素。近来,微流控技术在药物的高效率筛选及递送,生理及疾病模型的构建,以及组织修复的模拟等研究中表现出独特的优势,被用于构建功能性的“芯片实验室(Lab on chip)”。针对癌症及肿瘤问题,微芯片能提供可控条件以对应某些特定理化因素,单独地研究其作用下肿瘤细胞的生理特性及功能响应。这些芯片的构型大多较为简单或过于复杂,且多以单种细胞为考察对象,以单一因素为刺激条件。因此,能够有效地解析肿瘤发展的复杂过程和必要环节,整合癌细胞与肿瘤微环境的相互作用,已成为微流控模型的重要发展方向。为了应对研究者在条件综合性和视角整体性上的迫切需求,利用微流控技术在体外构建具有整合意义的多因素肿瘤研究模型还有巨大挑战。本研究对肿瘤微环境进行抽象及提取,设计多种构型并制备出微流控芯片平台,在体外构建起简单、有效的肿瘤细胞三维共培养模型,以便能在更具整合性的条件下分析肿瘤相关的细胞迁移行为。并应用该模型考察多种肿瘤细胞,针对肿瘤的发展及转移等相关问题分析其生物学效果,以期拓展新视角,帮助阐明细胞与肿瘤微环境的相互作用。本研究的主要内容为:(1)分析肿瘤发展及转移模型中基质浸润和血管生成等步骤,将微环境中血管、基质和肿瘤合理抽象为空间分布的微通道构型设计微流控芯片,并对简单三通道构型进行优化。结果显示:扩容的微通道尺寸促进了基质胶中HepG2和人脐静脉内皮细胞(ECs)三维结构的形成;正六边形微柱和梯形窄口微桥能更精确地控制和定位流体;真空贴合方式能对微流控芯片进行非永久性封装,有效地改善芯片在制作、清洗和再利用方面的不足。制备的芯片能从空间上、构型上、功能上满足多细胞共培养和多因素整合,为后续的细胞实验奠定了研究平台基础。(2)为了验证芯片在3D培养条件和生化因子作用方面相较于2D条件的优势,应用芯片对三种卵巢癌细胞系进行考察。通过对比2D和3D培养,配合NGF及其抑制剂形成生化因子条件,在多因素的微环境下分析了癌细胞聚集体的形成。结果显示,3D培养比2D生长更能促进CAOV3和OVCAR3形成明显的肿瘤细胞聚集体,且能有效影响SKOV3细胞的极化和伪足伸出。2D生长条件下三种细胞的形态和粘附能力虽受抑制剂Ro 08-2750拮抗的调节,而3D培养条件下NGF影响CAOV3(抑制)和OVCAR3(促进)聚团及受抑制剂拮抗的表现更为显著。结果初步验证了芯片在细胞3D培养、条件控制、功能考察和实时观察等方面的优势,支撑了肿瘤细胞三维共培养模型的建立。(3)整合肿瘤微环境中多细胞共培养,多培养维度,细胞与基质及细胞间相互作用,生化因子及浓度分布,空间几何分布等重要因素,在芯片中构建肿瘤细胞三维共培养模型。在构建的微环境下,考察了HepG2与CAOV3两种肿瘤细胞与ECs的三维共培养。结果显示,Hep G2细胞在基质胶中形成了3D细胞网络,共培养使ECs出现极化形态并伸出伪足,肿瘤细胞和内皮细胞的相互诱导促进了ECs向基质胶区域迁移和CAOV3浸润三维基质的能力,肿瘤细胞的侵袭行为对应了HepG2的低浸润和CAOV3的高浸润特性。相比于传统二维实验,模型展现了细胞更多的行为响应,提供了更多层次的可考数据。结果验证了该模型的功能,可以用于考察肿瘤生长和转移相关问题。(4)进一步应用肿瘤细胞三维共培养模型,结合传统实验综合考察肝癌干细胞样细胞(SC)诱导EC迁移。Western bolt和ELISA分析显示SCs在粘附、降解、迁移等过程中相关蛋白的表达水平高于成熟肝癌细胞(MC),Transwell迁移分析证明SCs在诱导ECs的迁移上强于MCs。芯片实验结果表明:SCs在基质胶中没有形成常规培养的球体形态;ECs伸出伪足向3D凝胶中迁移对应了血管萌芽早期行为,且受到肿瘤细胞共培养的促进;SCs在诱导ECs迁移方面的能力显著强于MCs;SCs受ECs影响可能更为敏感,在自身侵袭和转移功能方面展现出巨大潜能。芯片中的多因素条件较于传统迁移实验展示出了更多的细节,模型从多维度进行了综合的验证,提供了更具整合性的结果。综上所述:本研究设计的微通道构型及尺寸,选用的正六边形微柱及梯形微桥,采用的真空贴合封装方式,有效地改善了芯片在细胞生长、流体控制、制作使用等方面的功能;通过3D培养条件和NGF刺激对卵巢癌细胞粘附和聚集的显著影响,表明了在芯片中能更好地考察卵巢癌细胞聚集体的形成;基于芯片构建的体外肿瘤细胞三维共培养模型能够整合多因素在一定程度上模拟肿瘤微环境,肿瘤细胞能与ECs相互作用以促进向ECM中迁移,并表现出相应的浸润特性;应用模型考察肝癌干细胞样细胞,能有效评价SCs相比MCs在诱导ECs迁移方面更强的表现,及在侵袭能力上更大的转移潜能。以上实验结果表明:本研究设计制备的微流控芯片及肿瘤细胞共培养模型在研究癌细胞转移问题上,能更直观、全面地从癌细胞聚集体形成、生化因子刺激、细胞间相互作用、细胞迁移等多方面进行分析。通过多次对比2D和3D,传统实验和芯片模型,细胞种类和种间的方式,验证了该模型在功能上的优势。涉及的多类细胞从广度上评价了模型应用的高适应性,展现的更多细胞行为细节从深度上体现了模型在考察癌细胞聚团和肿瘤血管生成方面的发展潜力。方法不仅可用于考察癌症和肿瘤发展、转移等过程中的相关基础性问题,也可结合传统实验进行对比和验证,同时提供了多维度、多细胞、多因素的研究新视角和新思路,有望作为简单基础实验和复杂在体模型之间的一种新的补充。