胃癌细胞CDNA文库中三叶因子2相互作用蛋白基因筛选

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目的:筛选并克隆人胃癌细胞cDNA文库中与三叶因子2(trefoil factor family 2,TFF2)蛋白相互作用蛋白的基因。方法:应用RT-PCR方法验证胃癌细胞存在TFF2mRNA表达;应用PCR法扩增TFF2基因,NotⅠ和SalⅠ双酶切后定向克隆到酵母表达载体pDEST32,构建TFF2的诱饵质粒;应用western blot验证TFF2诱饵质粒在酵母细胞中相应融合蛋白的表达;将诱饵质粒和人胃癌-cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母感受态细胞,通过营养缺陷型培养基(Ura、His)和X-gal进行三重筛选阳性克隆,提取阳性克隆质粒测序,应用蛋白质数据库及生物信息学技术,对测序结果进行分析。结果:RT-PCR法成功证实胃癌细胞中存在TFF2mRNA表达;成功构建pDEST32-TFF2诱饵表达质粒;western blot法证实诱饵质粒转化酵母细胞后正确表达TFF2-GAL4DBD融合蛋白;通过酵母双杂交筛选胃癌细胞cDNA文库,共获得35个表达His、Ura、X-gal报告基因的阳性克隆,其中测序成功为16个克隆,包含12个已知蛋白基因、4个未知功能基因。结论:TFF2可能与胃癌的发生发展密切相关;从胃癌细胞CDNA文库中筛选出多种TFF2相互作用蛋白基因:进一步分析这些相互作用蛋白功能,初步探讨TFF2蛋白在胃癌发生发展中的可能作用机制。
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