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目的:应用分子生物学及免疫组化方法,研究皮瓣组织缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)损伤不同时间点相关凋亡基因p53表达的变化规律,探讨缺血再灌注损伤对皮瓣组织细胞凋亡及相关基因p53表达的影响,从基因水平,为临床上减轻直至消除皮瓣组织缺血再灌注损伤、提高皮瓣移植成活率,从调控细胞凋亡角度开辟新的治疗途径。方法:1实验动物:健康Wister大鼠40只,称重,编号。2实验动物分组:将大鼠随机分为2组,即对照组(非缺血再灌注组)和实验组(缺血再灌注组),每组20只,每组分为5个时间点取材,每个时间点4只。3皮瓣制备方法:2%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,每3小时追加一次(20mg/kg)以维持麻醉,大鼠仰卧,四肢固定,剪除腹毛,75%酒精消毒,按照Petry JJ等描述的方法,于右下腹设计一以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣,大小为6cm×3cm。对照组即非IR组:按上述方法制备皮瓣,皮瓣形成后原位缝合,不做其他处理;实验组即IR组:按上述方法制备皮瓣,皮瓣形成后,用微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近端的股动脉,8小时后手术去除血管夹。4取材:对照组的20只大鼠于掀起皮瓣即刻、9h、14h、20h、32h分别于皮瓣中段边缘取全层皮瓣组织1cm×0.5cm,实验组的20只大鼠于术后即刻、1h、6h、12h、24 h同法取材。将所取组织一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,及时制成石蜡切片,待做HE染色、免疫组化染色;将另一部分组织(约100mg)于液氮箱保存,备p53 mRNA检测。5检测方法及指标:(1)将石蜡切片进行HE染色,观察组织结构改变。(2)免疫组化检测及评分:对石蜡切片进行SP法免疫组化染色,染色步骤遵照试剂盒说明书进行,光镜下观察p53蛋白的分布和着色深浅程度,阳性与阴性对照同时进行,阳性信号以胞浆或胞膜有棕黄色或棕褐色颗粒为判断。免疫组化评分(immunohistochemical scores IHS)方法参照文献,结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分:a为阳性细胞百分比(无阳性细胞= 0,阳性细胞占1-10% = 1,11-50% = 2,51-80% = 3,81-100% = 4),b为阳性细胞染色强弱(阴性= 0,弱阳性= 1,中度阳性= 2,强阳性= 3),a,b两项乘积即为该例组织的IHS。(3)逆转录-多聚酶链反应法(reverse transcription,RT-PCR)半定量检测p53 mRNA水平:依据文献报道设计引物。引物序列:p53上游引物:5’- CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC -3’,p53下游引物5’-CTGTGCCGAAAAGTCTGCCTGTCGTC -3’。β-actin上游引5’-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG -3’,β-actin下游引物: 5’- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT -3’。按Trizol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,RNA保存在液氮中,电泳后于紫外透射仪观察,数码相机照相后输入微机,应用凝胶图象分析系统对目的电泳条带进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。6统计学处理:用SPSS13.0统计学处理软件,对不同类型数据进行不同的统计学处理。结果:1 HE染色组织学检查:非-IR组各时段皮下组织水肿轻,组织内炎性细胞浸润少见,细胞排列整齐。IR组术后1h,组织出现充血、水肿,表皮角质层开始出现局部破损,血管扩张,可见散在的局灶性中性粒细胞浸润,6h皮下组织水肿严重,皮肤各层结构疏松、紊乱,在血管周围可见大量中性粒细胞粘附、聚集,有大量白细胞、红细胞渗出到组织间隙; 24h原有情况继续加重,中性粒细胞进一步增多,血管的完整性破坏,皮肤坏死程度较重,结构不清。(图1~4)。2实验组术后即刻,再灌注1h、6h、12h、24h中p53相对表达量分别为(表5):(0.132±0.011)、(0.262±0.0528)、(0.371±0.057)、(0.467±0.068)和(0.552±0.047)。实验组在皮瓣缺血再灌注损伤后,p53mRNA的变化随着缺血再灌注时间的延长,该基因转录表达水平逐渐增高,至再灌注后24小时达到高峰,且实验组明显高于对照组(P < 0.05)。3免疫组化结果:光镜下观察,p53阳性细胞染色呈棕黄色或棕褐色。非IR组和IR组术后即刻,偶见p53蛋白表达在血管壁细胞,IR组术后9 h和33 h见上皮基底层细胞、皮下组织成纤维细胞、血管壁细胞、毛囊少量阳性细胞表达。IR组再灌注1 h上皮基底层细胞、皮下组织成纤维细胞、血管壁细胞、毛囊、皮脂腺和汗腺均有阳性表达,再灌注6h、12h、24 h p53蛋白表达部位与再灌注1h相同,但阳性细胞数呈上升趋势,阳性表达强度增加,(P < 0.05)。结论:皮瓣组织发生缺血再灌注损伤诱导时p53表达增加,这说明调亡相关基因p53参与缺血再灌注损伤机制,并为从基因角度调控皮瓣组织细胞凋亡提供理论依据。