论文部分内容阅读
内源性反转录病毒(ERV)是嵌在宿主细胞基因组的一类反转录元件,其在宿主胚胎干细胞及生殖细胞中残存的转录及反转座活性对于宿主基因组的保真性和稳定性造成了相当大的威胁。为了抵御ERV的伤害,高等真核生物除了在DNA水平上对其进行突变失活,还在表观遗传水平上对于MLV进行广泛多样的转录抑制。多梳蛋白家族(PcG)是一类通过修饰和改变染色质构象来调控基因转录的表观调控元件,通常以多梳抑制复合体(PRC1/2)的形式作用。近年来发现PcG参与调控ERV的转录抑制,PRC1与PRC2在此过程中是功能互补的,但具体的作用机理尤其是PRC1是如何独立于PRC2被募集至ERV的尚不清楚。本论文着重以ERV的一种类型—小鼠白血病病毒(MLV)为研究对象,通过生物信息学及分子生物学相关技术手段系统比较MLV不同个体拷贝对于招募PRC1能力的差异,寻找MLV中可能作为PRC1招募信号的顺式作用元件,进而揭示PRC1复合体识别并抑制MLV的分子机制。实验方法:(1)将C57BL/6小鼠品系的基因组序列作为参考基因组通过BLAT方法找到全部MLV独立拷贝的具体序列及插入位置的信息。(2)采用序列分析软件DNA STAR考察MLV在该基因组中的每个独立插入拷贝的序列完整性并将其含有大片段缺失的MLV进一步进行分类。(3)通过病毒载体系统构建一系列可诱导表达外源PRC1组分CBX7的稳转细胞系(不同遗传背景的胚胎干细胞系及畸胎瘤细胞),并验证该细胞系的相关生物学特性。(4)根据MLV的序列组成特点,设计特异性引物在不同遗传背景的小鼠细胞系中对MLV个体拷贝的插入位点进行Genotyping。(5)在不同遗传背景下对PRC1在不同MLV拷贝序列上的富集情况进行ChIP检测。(6)比较PRC1在不同MLV拷贝上富集程度的差异,将检测到能够高效募集PRC1的MLV拷贝进一步进行序列分析,总结序列组成的规律性。实验结果:(1)C57BL/6小鼠品系的基因组中存在73个拷贝的MLV的插入,它们整合在不同的染色体上。(2)存在序列组成相对完整及不同大片段缺失的MLV拷贝,根据缺失片段的具体位置将其分类。(3)成功构建了一系列不同遗传背景的、表达融合荧光蛋白的PRC1核心组分CBX7的稳转细胞系。(4)对不同遗传背景下的小鼠基因组中MLV的插入位置进行了系统的Genotyping,建立了每种细胞的MLV插入信息谱图。(5)ChIP-qPCR结果显示PRC1对于MLV不同拷贝的募集具有选择性,尤其对于一部分序列有缺失的MLV拷贝呈现高富集。(6)进一步研究发现MLV的序列本身对于招募PRC1是必需的,对特异性高募集PRC1的不同MLV拷贝的序列进行分析,逐步找到可能存在的招募PRC1的信号序列。