近年来随着肿瘤发病率逐渐增加,癌症患者趋于年轻化,治愈率较低,死亡率较高,肿瘤已经成为人类的一大“杀手”,严重危害人类的健康。从形态上,肿瘤可以分为实体瘤和非实体瘤,前者是一个主要由肿瘤细胞、间质细胞、肿瘤浸润免疫细胞以及供应肿瘤组织营养的血管组成。肿瘤浸润淋巴细胞的数量、功能以及类型决定了机体抗肿瘤免疫应答的效果,并且与患者预后关系极为密切。在肿瘤浸润淋巴细胞中发挥抗肿瘤免疫应答的主要是CD8+T淋巴细胞((cytotoxic lymphocytes,CTLs)和CD4+辅助性T淋巴细胞(Th),尤其是CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫反应是机体抗肿瘤免疫应答的基础。复杂的肿瘤微环境(tumor microenvironment)会造成肿瘤局部的免疫抑制,使肿瘤浸润的CD8+CTLs和CD4+Th1细胞处于一种功能耗竭或无能状态,无法对肿瘤进行免疫监视和清除。因此,寻找一种可以改变肿瘤微环境免疫抑制状态,提高机体自身免疫力,再次激活肿瘤浸润的淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocytes,TILs)或逆转其功能耗竭状态的新的分子和方法,已经成为抗肿瘤免疫治疗研究的一大热点。白细胞介素33(IL-33)于1999年首次被Onda H和其同事所发现并命名为DVS27,主要表达在犬脑血管痉挛细胞,分子量为30 k Da的蛋白。四年后,发现其相应的基因高表达在微静脉高内皮细胞核内,将该分子称为“高内皮微静脉核因子(NF-HEV)。2005年,Schmitz等人用计算机分析比较IL-1家族序列时,发现并证实IL-33(NF-HEV)是一个新的IL-1家族成员。IL-33与IL-1家族成员IL-1b和IL-18相似,人的IL-33基因位于人9号染色体(9q24.1)上。随后发现,IL-33是孤儿受体ST2(IL-1R-like-1)的功能性配体。其受体ST2选择性地表达在巨噬细胞、肥大细胞和Th2型细胞表面。最近研究发现,ST2也表达于Th1细胞。IL-33可以通过其受体ST2促进Th1型免疫应答并且可以影响病毒抗原特异性CD8+T淋巴细胞的功能。也有文献报道IL-33是一个可以促进小鼠Th1型和CD8+T淋巴细胞免疫应答的新型细胞因子,在介导抗肿瘤和抗慢性病毒感染的免疫应答过程中起重要的保护作用。但是IL-33在机体抗肿瘤免疫应答过程中的确切机制尚不明了。本实验室前期研究发现,IL-33及其受体ST2在人的多种肿瘤组织中低表达。另外,IL-33可以协同T细胞受体(T cell receptor,TCR)和白细胞介素12(IL-12)信号,刺激活化体外培养的小鼠T淋巴细胞,促进小鼠CD8+T细胞的效应功能。但对于其在抗肿瘤免疫应答作用和机制的研究还不透彻,而CD8+T淋巴细胞又是机体抗肿瘤免疫应答的关键和基础。因此,本课题首先探讨IL-33是否能直接作用于体外培养的人CD8+T淋巴细胞,增强其效应功能,继而构建荷瘤小鼠模型,探讨IL-33联合肿瘤疫苗对肿瘤的生长和转移的影响,以期为IL-33在肿瘤免疫治疗的潜在转化应用提供新的方法和理论依据。第一部分IL-33增强体外培养的人CD8+T淋巴细胞活化,并促进细胞因子的分泌【目的】探讨人白细胞介素IL-33(r IL-33)是否能够直接作于人CD8+T淋巴细胞,增强体外培养的人CD8+T淋巴细胞活化和效应功能,促进细胞因子分泌,为IL-33/ST2信号途径在肿瘤免疫治疗的潜在的临床转化应用提供一定的理论基础和依据。【方法】首先用密度梯度离心法从健康人外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMCs),再用免疫磁珠阳性富集纯化CD8+T淋巴细胞,分别用CD3单克隆抗体(m Ab)(50ng/ml+CD28 m Ab(200ng/ml);CD3 m Ab(50ng/ml)+CD28m Ab(200ng/ml)+IL-12(10ng/ml);CD3 m Ab(50ng/ml)+CD28 m Ab(200ng/ml)+IL-33(30ng/ml);CD3 m Ab(50ng/ml)+CD28 m Ab(200ng/ml)+IL-12(10ng/ml)+IL-33(30ng/ml),四种细胞因子组合刺激培养,24h和72h后收集细胞。采用免疫荧光标记,流式细胞术检测分选的CD8+T淋巴细胞纯度以及IFN-γ、IL-33受体ST2、CD107a等分子的表达;采用realtime PC R(q RT-PCR)检测各组细胞的γ干扰素(IFN-γ)、颗粒酶B(granzyme B)、IL-21、IL-10、TIM-3、TNF-α、ST2、CCL20等分子m RNA水平表达。运用Cytometric Bead Array(CBA)试剂盒,流式细胞术检测24h、72h细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17a的表达。【结果】1.流式细胞术检测免疫磁珠分选富集的CD8+T淋巴细胞纯度在95%以上,符合实验要求;2.人CD8+T淋巴细胞在m RN A和蛋白水平表达IL-33的受体ST2;3.IL-33可以直接作用于人的C D8+T淋巴细胞,并且有浓度依赖效应,组间差异具有统计学意义(P<0.05);4.镜下观察,各组细胞因子刺激的CD8+T淋巴细胞形态没有明显差异;5.流式细胞术检测经4组不同细胞因子组合刺激后CD8+T淋巴细胞形态大小,组间无明显差异;6.IL-12上调IL-33的受体ST2在人CD8+T淋巴细胞的表达,组间差异具有统计学意义(P<0.05);7.IL-33促进人CD8+T淋巴细胞IFN-γ的表达,与IL-12联合组上调作用更加显著,组间差异具有统计学意义(P<0.05);8.加入细胞因子IL-33或IL-12刺激,人CD8+T淋巴细胞膜表面的CD107a表达水平升高,IL-33和IL-12联合刺激组上调更明显;9.经realtime-PCR检测,IL-33刺激组的CD8+T淋巴细胞GZ-B、CCL20等m RNA表达水平升高,组间差异具有统计学意义(P<0.05);10.IL-33下调TIM-3、LAG-3等负性共刺激分子m RNA在CD8+T淋巴细胞中的表达,组间差异具有统计学意义(P<0.05);11.IL-33对其他分子(IL-12R、IL-2、perforin、PD-1等)表达无影响。【结论】IL-33能够增强体外培养的人CD8+T淋巴细胞的活化效应功能,促进细胞免疫应答,有望为肿瘤免疫治疗提供新的依据或策略,具有潜在的临床应第二部分IL-33增强肿瘤疫苗的效应功能【目的】初步探讨IL-33是否能增强肿瘤疫苗效果,增强小鼠体内肿瘤浸润的CD8+T淋巴细胞的效应功能,抑制肿瘤生长和转移,延长荷瘤小鼠生存期。【方法】在C57BL/6 WT小鼠腹部外侧皮下接种B16黑色素瘤细胞1×105个细胞每只小鼠,构建荷瘤小鼠模型。在接种肿瘤细胞的第4天开始,每隔4天在荷瘤小鼠肿瘤对侧皮下接种辐照后的肿瘤细胞疫苗,分别是PBS、B16、B16IL-33、B16IL-33+B16IL-12,每只皮下接种肿瘤细胞疫苗5×105个细胞,共接种4次。每隔2天测量并记录小鼠的肿瘤生长大小和观察小鼠的生存状况,绘制小鼠肿瘤生长曲线和生存曲线;并在肿瘤早期,即第10天,经免疫荧光标记和流式细胞术检测分析各组荷瘤小鼠肿瘤微环境中CD8+IFN-γ+T淋巴细胞的比例。【结果】1.IL-33可以增强小鼠肿瘤疫苗效应功能,抑制肿瘤生长,与B16对照组相比,差异具有统计学意义,P<0.05;2.IL-33可以明显延长荷瘤小鼠的生存期,与B16对照组相比具有统计学意义,P<0.05;3.IL-33可以促进肿瘤浸润的CD8+T淋巴细胞的分泌IFN-γ。【结论】IL-33能增强小鼠体内肿瘤浸润的CD8+T淋巴细胞的效应功能,抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期,B16IL33+B16IL12疫苗联合组效果更加显著。