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杉木在生长过程中经常会受到干旱、铝毒等不良环境的非生物胁迫,这些非生物胁迫往往会对杉木造成不可逆的伤害,严重时甚至引起死亡,因此,非生物胁迫已成为限制杉木生长和人工林产量提升的重要障碍因子。天冬酰胺作为植物氮代谢过程中重要的氨基酸,是植物体内游离氨基酸的主要成分,由于其具有较高的氮碳比和更强的稳定性,因此,天冬酰胺可作为植物体内氮运输和贮藏的工具。天冬酰胺合成酶作为催化合成天冬酰胺的酶蛋白,可以响应不同的外界逆境条件。本研究通过克隆杉木ASN基因,并对非生物胁迫下杉木ASN酶活性、ASN基因定量表达模式、Asn含量变化及遗传转化进行分析,以期初步了解ASN基因在非生物胁迫下的表达规律及功能,同时也为后续人为调控ASN基因进而培育抗性强的杉木品种奠定理论基础。1杉木天冬酰胺合成酶基因克隆与生物信息学分析本试验成功分离杉木ASN3基因,该基因为一个完整的编码框,共编码231个氨基酸,对其所编码的蛋白进行生物信息学分析,发现该蛋白为不含卷曲螺旋结构和信号肽的非跨膜稳定亲水蛋白,具有多样的磷酸化位点,其中丝氨酸15个,苏氨酸7个,酪氨酸3个,其二级及三级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。2非生物胁迫下杉木天冬酰胺合成酶活性的变化以杉木组培苗为试验材料,测定盐胁迫、糖分胁迫和氮胁迫下杉木天冬酰胺合成酶活性的变化。结果表明:①在盐胁迫24 d后,随着胁迫时间增加,NaCl浓度越大的杉木ASNS活性就越高,在胁迫40d,3.2g/LNaCl时,ASNS活性达到最高;②在糖分胁迫下,随着胁迫时间的增加,50 g/L和70 g/L糖时,ASNS活性呈现升-降的趋势,90 g/L糖时,ASNS活性呈现先升-降-升的趋势,在胁迫第24 d,50 g/L糖时,ASNS活性达到最高;③在氮胁迫下,随着胁迫时间的增加,完全缺N、3/2N、4/2N胁迫下,ASNS活性均呈现升-降的趋势,1/2N胁迫下,ASNS活性均呈现降-升的趋势,在胁迫16 d,4/2N时,杉木ASNS活性达到最高。3非生物胁迫下杉木天冬酰胺合成酶基因定量表达分析以杉木组培苗为试验材料,测定盐胁迫、糖分胁迫和氮胁迫下杉木天冬酰胺合成酶基因表达情况。结果表明:①在盐胁迫下,随胁迫时间的延长,天冬酰胺合成酶基因在0.8 g/LNacl下呈先升后降趋势;1.6 g/LNacl下呈升-降-升的变化趋势;3.2 g/LNacl下,则呈先升后降趋势,在24 d后,其表达量变化较小。不同浓度盐胁迫处理能显著诱导ASN3基因的表达,但在胁迫后期,盐胁迫对该基因表达没有显著影响。②在糖分胁迫下,随胁迫时间的延长,50 g/L和70 g/L糖时,天冬酰胺合成酶基因表达量均呈先升后降趋势,均在24 d时达到最大值;90 g/L糖时,则整体呈先升后降趋势,其中在8-16 d和32-40 d这两个过程中,表达量变化较小。糖分胁迫也能不同程度诱导ASN3基因的表达,但在糖胁迫后期,该基因表达受到抑制。③在氮胁迫下,在不同胁迫时期缺氮均抑制该基因的表达,随着氮浓度的增加,该基因受氮诱导上调表达,4/2 N与3/2N处理条件下,该基因受上调诱导表达均较为显著,1/2N氮处理显著抑制该基因表达。ASN3基因对不同氮浓度响应存在显著差异,缺氮或低氮处理能显著诱导ASN3表达,而高氮处理则显著抑制该基因表达。4非生物胁迫下杉木天冬酰胺含量变化分析采用酶联免疫法对盐胁迫、糖胁迫和氮胁迫下的杉木Asn含量进行测定,结果表明,在盐胁迫、糖胁迫和高氮胁迫下,杉木Asn含量均有不同程度地增加,在缺N和1/2N下Asn含量呈下降趋势。5杉木遗传转化中抗生素种类和浓度的筛选。以杉木组培苗茎段和嫩芽为植物材料,分析了不同浓度的卡那霉素、潮霉素和头孢霉素对杉木茎段和嫩芽生长的影响,同时分析了头孢霉素对农杆菌GV3101的抑菌效果。结果表明,40 mg/L的潮霉素培养42 d时,杉木嫩芽及茎段存活率仅为8.78%和13.97%;当潮霉素浓度继续增至60 mg/L和80 mg/L时,杉木嫩芽及茎段存活率持续下降,直至其生长完全被抑制。因此,可将40-60 mg/L和60-80 mg/L的潮霉素分别作为杉木遗传转化过程中转化苗第一次和第二次筛选的选择压。当卡那浓度为100 mg/L时,对杉木嫩芽和茎段生长的影响较小,不适宜作为杉木遗传转化苗的抗性筛选。头孢霉素浓度为300 mg/L时能有效抑制农杆菌GV3101生长,且在该浓度下杉木嫩芽及茎段增殖效果良好,新长出的杉木苗呈深绿色,长势良好,可做为抑菌浓度。6杉木天冬酰胺合成酶基因的遗传转化分析采用叶盘法将杉木ASN1基因转化烟草,以ASN-ORFF、ASN-ORFR进行转基因烟草PCR验证,PCR结果显示在转基因烟草中扩增到与目的基因大小一致的片段,说明已获得转杉木ASN1的烟草植株。进一步对转ASN1基因烟草进行耐铝性分析,结果表明铝胁迫下,转基因烟草叶片中的H2O2和MDA含量显著低于野生型,且转基因烟草叶片中的ASN1基因的表达量显著上升,明显高于野生型烟草,说明转ASN1基因烟草具有较强的耐铝能力。通过针叶处理方式、OD600值、浸染时间、共培养时间和AS浓度进行杉木天冬酰胺合成酶基因遗传转化正交试验。结果表明,在抗性筛选过程中,剥除针叶更多的茎段更早出现枯萎且现象更明显,这可能是由于针叶的剥除虽可增加受体材料表面的伤口,利于重组质粒的转移,但是伤口增加的同时也对受体材料的生理状态产生了不利的影响,进而增加其对抗生素的敏感性,致使其在抗性培养条件下无法正常生长,最终死亡。本试验最终未能成功将杉木天冬酰胺合成酶基因整合到杉木茎段中,没有实现实验目的。