经典的CDK(cyclin dependent kinase)家族分子参与真核细胞的细胞周期调控。CDK11家族蛋白已发现三个成员:CDK11p110、CDK11p58和CDK11p46。CDK11p110广泛表达于各个组织和细胞周期,主要参与转录调控和前体mRNA的剪切过程。CDK11p46是在某些凋亡信号刺激下,大的CDK11家族分子被剪切形成的含有C端激酶结构域的小分子,其功能与细胞凋亡信号的转导有关。我们实验室的研究发现,在诱导3T3细胞失巢凋亡的过程中,CDK11p46可被诱导表达,并且CDK11p46与PAK1(p21 activated kinase 1)分子相互结合并抑制了PAK1的激酶活性。进一步的研究证明PAK1被抑制之后,对BAD分子的抑制性磷酸化(Ser112和Ser136两个丝氨酸位点)降低,从而BAD的线粒体转位增加,造成细胞色素c的释放,进而引起细胞凋亡。CDK11p46对PAK1的抑制作用和CDK11p46的激酶活性有关,激酶活性缺失的D149N不能抑制PAK1激酶的活性和BAD的磷酸化状态,因此不能使细胞发生凋亡。CDK11p58是最早发现的CDK11家族成员,在β1-4半乳糖基转移酶1的分离纯化中得到,能磷酸化β1-4半乳糖基转移酶1并对β1-4半乳糖基转移酶1的活性起增强作用。CDK11p58在细胞内特异表达于G2/M期,过表达CDK11p58的细胞导致细胞生长缓慢,细胞周期变化,有丝分裂障碍,细胞阻滞于G2/M期。过表达CDK11p58能增强某些凋亡刺激造成的细胞凋亡。cdc2L基因敲除的小鼠导致的早期胚胎凋亡中,伴随有胚胎细胞有丝分裂停滞等现象,也提示了CDK11p58在真核细胞的有丝分裂过程中发挥很关键的作用。CDK11p58对有丝分裂纺锤体的组装成熟和维持正常有丝分裂的进行起重要作用,进一步有人报道CDK11p58亦在维持姐妹染色单体的正常形态和正常分离发挥作用。虽然CDK11p58参与了有丝分裂M期的调控,但具体的分子机制尚不清楚。　　 PAK1属于一类丝/苏氨酸蛋白激酶家族p21 activated kinase family之一员,在各个组织广泛表达并通过依赖或者不依赖于其激酶活性的方式参与调控一系列广泛的生理过程和信号转导途径,比如细胞生存信号、增殖、细胞骨架动力学改变和细胞迁移、细胞周期调控、转录调控以及肿瘤发生等。有丝分裂M期细胞Pak1T212位磷酸化增强且胞内定位发生改变,T212磷酸化的PAK1主要定位于中心体附近,而与CDK11p58的M期定位大致相同。CDK11p58与PAK1之间的联系至今未有报道。我们的研究表明PAK1可作为CDK11p58激酶的体外底物。通过构建PAK1的缺失突变体和点突变体,我们发现研究表明丝氨酸174位是其体外的磷酸化位点。体内的磷酸化实验亦证实CDK11p58可磷酸化修饰PAK1Ser174位点。通过定点诱变我们构建了模拟Ser174位点持续磷酸化和去磷酸化的突变体174E和174A。我们发现174E在细胞M期的定位类似于以前报道的野生型PAK1的定位,而174A失去了这种特异的定位形式。进一步的研究表明相比174A,174E与DLC2(Dynein light chain 2)的结合明显增强。体外的直接结合实验也证实了CDK11p58激酶处理后的His-PAK1与DLC2的结合能力上升。DLC2在体内与myosinV形成蛋白复合物,通过年免疫共沉淀实验我们同样发现174E与myosinV复合物的结合也强于174A。这说明在细胞M期的进展过程中,CDK11p58激酶可能通过对PAK1Ser174位点的磷酸化修饰调节其亚细胞定位。在进一步的功能研究中,我们构建了稳定表达PAK1174E和174A的A375黑色素瘤细胞株,通过改良的MTT生长曲线测定我们发现同对照细胞株和174A稳转株相比,174E稳转细胞株的生长曲线变慢。用nocodazole阻滞上述A375稳转株于G2/M期,然后分别释放,我们发现稳定表达174E的细胞细胞周期的进展明显加快,而174A细胞株的细胞周期进展显著减缓,这说明PAK1Ser174位点的磷酸化的精确调控对于维持正常的细胞周期进展以及细胞的生长不可或缺。我们的实验也提示了PAK1可作为CDK11p58M期特异的效应分子发挥作用。这将使我们对CDK11p5g和PAK1激酶的功能以及二者之间的联系有进一步认识,有助于了解真核细胞M期调控的分子机制。　　 为进一步研究CDK11家族成员与PAK1之间的关系,需要获得大量具有生物学活性的和近似于体内修饰的蛋白。我们应用昆虫杆状病毒表达系统,首先体外构建了重组的表达His-CDK11p46和His-PAK1的AcNPV病毒,并转染sf9细胞株得到了重组病毒株P1,通过进一步的感染和扩增,得到高滴度的P3病毒株。Western blot分析证实了两种蛋白病毒感染之后在sf9细胞中的表达。我们进一步优化了两种重组蛋白的表达条件,并用镍珠对CDK11p46进行了初步纯化分析。我们的实验为进一步的CDK11p46与PAK1的功能研究奠定了基础。