疟疾(Malaria)是由寄生人体的疟原虫引发的传染病,与艾滋病、结核一起被世界卫生组织(WHO)列为全球三大公共卫生问题。疟疾的治愈与消除受到全球普遍关注。疟疾临床诊断主要依赖于镜检和免疫学快速检测(RDT)方法。然而,镜检诊断灵敏度低,对于有经验的镜检人员依赖性较重；免疫学方法受环境条件及疟原虫多态性的影响较大且对低原虫密度的误诊率较高,新近有研究认为特定基因(pfhrp2)的缺失会影响诊断灵敏度等缺点。在分子诊断方法中,PCR技术因具有灵敏度高、特异性强等优点,能够对不同的疟原虫种类进行准确检测诊断。但是该方法由于昂贵的成本,模板制备的高要求及繁琐操作,使得该技术在大规模疟疾流行性调查中的应用受到限制。本研究针对目前疟原虫检测诊断中存在的问题,开发疟原虫诊断新方法和改进检测手段。并对特定地区的pfhrp2基因多态性进行了分析,以期为该地区免疫学快速检测方法的使用提供理论依据。(1)本研究首先建立了一种直接使用经saponin常温处理的疟原虫滤纸血样品作为DNA模板的疟原虫PCR检测方法(FP-PCR),将单样本模板制备的时间由使用Qiagen试剂盒提取所需的90-100 min缩短至10-12 min,大大提高了检测的时效性,并将制备成本减少至原来的四十分之一,有效降低了检测费用。该方法的检出限达到0.2寄生虫/μL,比目前临床普遍采用的镜检方法高50倍。同时,模板制备时不需加热过程,避免了样本的交叉污染。(2)其次,在简化PCR反应中模板制备的繁琐操作及降低成本的基础上,进一步优化套式PCR第二步反应体系,将原先的分四管反应鉴定不同疟原虫种简化为单管一个反应体系内同时鉴定四种不同疟原虫,建立了一个混合体系的疟原虫PCR诊断技术(Multi-FP-PCR)，该方法具有降低反应数、减少试剂消耗的优点,将PCR反应的检测时间缩短一半以上,其重新优化的特异性引物扩增结果差异显著,提高了检测的临床操作性。(3)同时,本研究还对恶性疟原虫hrp2基因的多态性和缺失情况进行了探究,发现4例缺失虫株。对于恶性疟原虫hrp2基因是否会对RDT的灵敏度造成影响,需要更加深入的研究。